microRNA133b的单核苷酸多态性与脑卒中的相关性的初步探讨

马国祥 丁茜萍 邓海华 杨振汉



microRNA133b的单核苷酸多态性与脑卒中的相关性的初步探讨

马国祥 丁茜萍 邓海华 杨振汉

目的 探讨microRNA133b的SNP单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与脑卒中的相关性。方法 收集本院神经内科2012年9月～2016年9月1200例脑卒中患者的临床资料，将其定义为观察组，同时以1200例体检健康者作为正常对照组，观察2组血液中的microRNA133b的表达水平、microRNA133b的单核苷酸多态性以及各组中相关的临床参数。结果 观察组中脑卒中患者的饮酒史和高血压病史的比例都显著高于正常对照组(P<0.05)；观察组脑卒中患者血清总胆固醇(total cholesterol，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDLC)、空腹血糖、甘油三酯(triglyceride，TC)以及C反应蛋白的水平都显著高于正常对照组(P<0.05)；观察组脑卒中患者血清中高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDLC)水平显著高于正常对照组(P<0.05)；观察组脑卒中患者的microRNA133b中SNP+112A/T基因在A位点的基因频率显著高于正常对照组(P<0.05)；microRNA133b的水平与血清LDLC的水平呈显著正相关(r=0.7，P<0.05)。结论 microRNA133b位点的单核苷酸位点基因多态性以及患者血清血脂代谢的紊乱可能都是脑卒中发生的重要影响因素，microRNA133b位点的单核苷酸位点基因多态性位点可能是脑卒患者潜在的分子标记物。

脑卒中 microRNA133b 单核苷酸多态性 影响因素

脑卒中属于神经系统重要疾病之一，具有发病率及病死率较高的特点[1]。最新的数据显示，在我国乃至世界范围内脑卒中是排在首位的神经系统性疾病[2-3]。脑卒中严重威胁着患者的生命和健康，然而脑卒中的治疗效果尚不理想，更重要的是人们对脑卒中的发病机理尚不完全清楚。影响脑卒中发生的因素很多，既有环境因素，又有基因因素，其中与脑卒中发生发展密切相关的基因及其发挥作用的分子机制尚需进一步探讨[4-5]。

据最新的数据显示，脑卒中发病的影响因素很多，例如生活习惯、不合理的膳食、过量饮酒、肥胖、糖尿病、缺乏运动、高血压病、高脂血症、种族、性别、年龄和血管性因素等[6-8]。其中，高血压病、不合理膳食和运动、饮酒和基因因素是脑卒中的最重要影响因素[9-10]。进一步的研究提示，脑卒中患者血清总胆固醇(total cholesterol，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDLC)、空腹血糖、甘油三酯(triglyceride，TC)以及C反应蛋白的水平是导致脑卒中最直接和重要因素[11-12]。因为血脂过高容易导致脑血管堵塞甚至破裂，最终导致大脑组织的直接损伤和大脑局部缺血和坏死，所以，血脂是脑卒中发生的关键[13-15]。血管生成素和血管生成和修复相关的血管内皮生长因子直接参与了脑卒中的发生[16-18]。

microRNA是一类非编码的小RNA，其功能广泛，例如microRNA参与细胞周期、细胞增殖和分化、细胞信号转导和细胞凋亡[15-17]。最新的研究表明，microRNA133b与人们的脂类代谢的调节和紊乱密切相关，microRNA133b血清水平代表人类的血脂状况[11]。然而，microRNA133b是否直接或间接的与心血管疾病的发生或发展有关尚不清楚，心脏病患者血清microRNA133b表达水平上调[12]，这暗示microRNA133b也可能参与了脑卒中[13]。

因此，本研究收集本院神经内科2012年9月～2016年9月1200例脑卒中患者的临床资料，将其定义为观察组，同时以1200例体检健康者作为正常对照组，将探讨脑卒中发生发展的临床因素、microRNA133b在患者血液中的表达水平、是否存在microRNA133b的SNP(单核苷酸多态性)以及microRNA133b与脑卒中的相关性，以期为脑卒中及相关疾病的诊断、预防、治疗和预后提供一些的理论基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集本院神经内科2012年9月～2016年9月1200例脑卒中患者的临床资料，将其定义为观察组，同时以1200例体检健康者作为正常对照组。本研究得到本院伦理委员会的审核和批准。所有的脑卒中患者及其健康志愿者均签署了知情同意书。

按照文献报道的标准[12]，对脑卒中患者进行严格的入选或排除。观察组1200例脑卒中患者都经过医学影像学、临床病理学和分子生物学的检测和确诊。所有脑卒中患者的年龄都>60岁。观察组1200例脑卒中患者无脑血管疾病史，也没有家族史。脑卒中研究对象的病例资料完整。

1.2 血液样本的收集和处理

抽取脑卒中患者和正常对照组患者的静脉血，对血液样品进行柠檬酸抗凝预处理，所有血液样本经低速离心，150 r/min×10 min，收集血清样品，保存于-90 ℃冷冻室备用。

1.3 血液样品的RT-PCR检测

按照文献报道的的方法提取血液样本的基因组RNA，进行常规反转录，得到cDNA；再以cDNA为PCR的模板，进行常规的PCR反应。具体流程和体系见表1；PCR反应体系和具体条件见表2。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应体系和条件

1.4 临床基本血液参数的检测

使用上海生物工程责任有限公司生产的血液全自动检测仪分析脑卒中患者以及正常对照组的临床一般血液指标和参数，检测指标有血清总胆固醇(total cholesterol，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDLC)、空腹血糖、甘油三酯(triglyceride，TC)以及C反应蛋白的水平。

1.5 microRNA133b基因表达水平的检测、序列分析和SNP(单核苷酸多态性)分析

按照常规的方法使用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的相对表达量，并对获得的PCR扩增的基因片段进行深度测序。在pubmed中查找microRNA133b的基因序列，对测序和microRNA133b的基因序列比对，分析microRNA133b基因的多态性。

计算脑卒中患者和正常对照组血清中microRNA133b基因在SNP+112A/T位点的基因型分布情况和等位基因频率。microRNA133b基因在SNP+112A/T位点的等位基因的频率=一种类型microRNA133b基因的个数/(该类型microRNA133b基因的个数+microRNA133b等位基因的个数) 。

1.6 统计学处理

采用SPSS 17.0软件，所有数据和变量以平均值±标准误表示，使用单因素方差分析组内因子的差异，而不同组间的分析采用成对的t检验，脑卒中的相关因素分析采用Logistic回归方析及直线相关性分析。当P<0.05判断差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 观察组脑卒中患者和正常对照组一般资料的比较

如表3所示，观察组脑卒中患者的高血压病史和饮酒史的比例都显著高于正常对照组(P<0.05)，但是2组在性别、年龄、糖尿病史、病程和体质指数等指标方面无明显差异。

表3 观察组脑卒中患者和正常对照组一般资料的比较

2.2 观察组和正常对照组血液学参数的比较

观察组脑卒中患者血清总胆固醇(total cholesterol，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDLC)空腹血糖、甘油三酯(triglyceride，TC)以及C反应蛋白的水平都显著高于正常对照组(P<0.05)；观察组脑卒中患者血清中高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDLC)水平显著高于正常对照组(P<0.05)(表4)。

表4 观察组和正常对照组血液学参数的比较

2.3 观察组和正常对照组SNP+112A/T基因型频率和等位基因频率数据的分析

观察组脑卒中患者的microRNA133b中SNP+112A/T基因在A位点的基因频率显著高于正常对照组(P<0.05)；microRNA133b的水平与血清LDLC的水平呈显著正相关(r=0.7，P<0.05)(表5)。

表5 观察组和正常对照组SNP+112A/T基因型频率和等位基因频率数据的分析结果

2.4 观察组脑卒中患者发病影响因素的Logistic回归分析

表6显示，高胆固醇、高甘油三酯、饮酒和112A/A基因型是影响脑卒中的重要影响因素。

表6 观察组脑卒中患者发病影响因素的Logistic回归分析

2.5 microRNA133b的水平与血清LDLC水平的关系

直线性相关分析显示，microRNA133b的水平与血清LDLC水平呈显著正相关(r=0.7，P<0.05)(图1～2)

3 讨 论

脑卒中严重威胁患者的生命和健康，因此对脑卒中发生发展影响因素的分析既有理论意义，又有实用价值[1-3]。以往的研究提示，microRNA可能与机体的病理学状态密切相关[14]。本研究探讨了microRNA133b在患者血液中的表达水平、是否存在microRNA133b的SNP(单核苷酸多态性)以及microRNA133b与脑卒中的相关性，以期为脑卒中及相关疾病的诊断、预防、治疗和预后提供一些理论基础。

图1 microRNA133b的水平与血清LDLC水平的关系

图2 观察组和正常对照组中microRNA133b的表达水平 与对照组比较,*P<0.05

本研究结果显示，(1)观察组中脑卒中患者的饮酒史和高血压病史的比例都显著高于正常对照组(P<0.05)。这与以往的研究结果一致[28]；(2)观察组脑卒中患者血清总胆固醇(total cholesterol，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDLC)、空腹血糖，甘油三酯(triglyceride，TC)以及C反应蛋白的水平都显著高于正常对照组(P<0.05)；观察组脑卒中患者血清中高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDLC)水平显著高于正常对照组(P<0.05)；(3)观察组脑卒中患者的microRNA133b中SNP+112A/T基因在A位点的基因频率显著高于正常对照组(P<0.05)；(4)microRNA133b的水平与血清LDLC的水平呈显著正相关(r=0.7，P<0.05)，这提示microRNA133b可能是潜在的脑卒中患者发生和发展的特异性分子标记物。这些结果与以往的研究结论一致[17，20]，即脑卒中患者血脂、血糖紊乱是该疾病发生发展的重要影响因素，同时也是脑卒中引起的结果。本研究microRNA133b的水平与血清LDLC的水平呈显著正相关(r=0.7，P<0.05)，这是目前报道中未发现的结果，也是一个创新点，即microRNA水平可能与脑卒中呈正相关。总之，microRNA133b位点的单核苷酸位点基因多态性以及患者血清血脂代谢的紊乱可能都是脑卒患者发生疾病的重要影响因素，microRNA133b位点的单核苷酸位点基因多态性位点可能是脑卒患者潜在的分子标记物。

本研究的不足与缺点：(1)虽然本研究包含了1200例脑卒中患者，但是对于临床发病机理的研究来说，研究对象仍然较少，本研究的结果仍需增加脑卒中病例数以便进一步论证；(2)本研究缺少microRNA133b在脑卒中发挥作用的具体分子机理；(3)本研究缺少脑卒中大鼠等动物模型的进一步验证。

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(2016-10-09收稿)

A preliminary study on the correlation between single nucleotide polymorphism of microRNA133b and stroke

Ma Guoxiang, Ding Qianping, Deng Haihua, et al.

Department Of Medicine, Fuyong People's Hospita of Shenzhen Baoan District, Shenzhen 518103

Objective To investigate the correlation between single nucleotide polymorphism(SNP) of microRNA133b and stroke.Methods The clinical data of 1200 patients with stroke(the observation group) were collected in our hospital from September 2016 to September 2012 . At the same time, 1200 healthy persons were taken as the normal control group. The microRNA133b expression level of the blood, clinical parameters related to microRNA133b and single nucleotide polymorphism were detected in two groups.Results The ratio of drinking and hypertension were significantly higher in the observation group than those in the normal control group (P<0.05). The total cholesterol (TG), low density lipoprotein cholesterol cholesterol(LDLC), fasting blood glucose, triglyceride (TC) and C reactive protein level were significantly higher in the observation group than those in the normal control group (P<0.05). The density lipoprotein cholesterol (HDLC) level was significantly higher in the observation group than that in the normal control group (P<0.05). The frequency of SNP+112A/T gene in A was significantly higher in the observation group than that in the normal control group (P<0.05), the frequency of the SNP+112A/T gene was significantly higher than that in the normal control group (P<0.05). There was a significantly positive correlation between the microRNA133b level and the serum LDLC level.Conclusion The microRNA133b single nucleotide polymorphism loci and serum lipid metabolism disorder were the important influencing factors in stroke, single nucleotide polymorphism loci of microRNA133b locus might be the potential molecular marker of stroke patients.

Stroke MicroRNA133b Single nucleotide polymorphism Influencing factor

518103 广东省深圳市宝安区福永人民医院内科

R743.3

A

1007-0478(2017)03-0185-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.03.004