胍那苄对运动神经元的内质网应激细胞模型具有保护作用

姜宏佺 丰宏林 孙晓嘉



·论 著·

胍那苄对运动神经元的内质网应激细胞模型具有保护作用

姜宏佺 丰宏林 孙晓嘉

目的 探讨P-eIF2α去磷酸化抑制剂胍那苄(guanabenz，GA)对胚胎小鼠运动神经元样杂交细胞系(mouse motor neuron-like hybrid cell line,NSC34)的内质网应激模型是否具有保护作用及是否能够减少外源性SOD1 G93A蛋白的合成。方法 (1)应用依霉素(Tunicamycin，TM)作用到鼠运动神经元样杂交细胞系(mouse motor neuron-like hybrid cell line,NSC34)，获得运动神经元ERS模型；再给予不同浓度的GA通过显微镜及MTT方法观察GA对运动神经元ERS模型细胞数量及细胞活力的影响；用Western Blot方法检测TM、GA对NSC34细胞系ERS蛋白eIF2α和P-eIF2α的影响；(2)应用慢病毒转染的方法制作SOD1 G93A NSC34稳定转染细胞系，通过Western blot方法检测GA对外源性SOD1 G93A蛋白以及内源性mouse SOD1蛋白表达量的影响。结果 (1)在NSC34的ERS模型中多个浓度的GA与对照组比较可以显著增加细胞数量，提高细胞活力(P<0.05)；GA可以增加ERS相关蛋白P-eIF2α的表达量；(2)GA在SOD1 G93A NSC34细胞系中能够减少外源性hSOD1蛋白的表达量，而对内源性的mouse SOD1蛋白表达量没有明显影响。结论 (1)GA可能通过增加P-eIF2α的表达量而对NSC34细胞系的ERS模型具有保护作用；(2)GA在SOD1 G93A NSC34细胞系中可以减少外源性hSOD1蛋白的表达量。

神经系统变性病 肌萎缩侧索硬化 胍那苄 内质网应激 SOD1

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)又称Charcot病或Lou Gehrig病，是一种致死性神经系统变性病，以脊髓前角细胞、脑干运动神经核和锥体束同时受累，以上、下运动神经元损害并存为特征，致使随意运动逐渐丧失、呼吸肌麻痹或合并呼吸道感染而最终死亡，平均病程3～5年[1]。ALS是一个多因素作用的疾病，它的确切发病机制尚不清楚，可能与SOD1基因突变、线粒体功能障碍、氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、内质网应激、胶质细胞病变、自噬、免疫炎症等机制有关[2-3]。近年来内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)逐渐成为ALS研究领域的热点[4-6]。我们的前期研究发现胍那苄(guanabenz，GA)作为P-eIF2α去磷酸化抑制剂，可以延长ALS转基因小鼠的生存期，延缓发病时间及运动功能减退[7]。Wang等[8]人的研究也得到类似的研究结果。GA在ALS细胞水平上的研究尚未见报道。

鼠运动神经元样杂交细胞系(mouse motor neuron-like hybrid cell line,NSC34)是胚胎小鼠脊髓运动神经元与小鼠神经母细胞瘤杂交而形成的运动神经元样细胞系，它同时具有了运动神经元的特征如动作电位的产生、乙酰胆碱的分泌、轴突的延伸等；又拥有肿瘤细胞可以传代的特征[9]，是目前研究运动神经元最好的细胞模型之一[10]。衣霉素(Tunicamycin，TM)是一种细菌和真核生物N-乙酞胺基葡萄糖转移酶的抑制剂，能够阻止N-乙酞胺基葡萄糖脂质中间代谢产物的形成和新合成糖蛋白的糖基化，引起错误折叠蛋白在内质网内积聚，从而诱发ERS[11]。本研究旨在探讨GA对NSC34细胞系的内质网应激模型是否具有保护作用及是否能够减少外源性SOD1 G93A蛋白的合成。

1 材料与方法

1.1 实验材料及主要仪器

NSC34细胞系购于加拿大CEDARLANE Corporation；Anti-eIF2α(CST公司， 美国)； Anti-P-eIF2α(CST公司， 美国)；Anti-SOD1(北京博奥森公司，中国)；依霉素(sigma公司，美国)；胍那苄(sigma公司，美国)；MTT粉末(sigma公司，美国)；DMEM(Sigma公司，美国)；Anti-actin(Santa Cruz公司，美国)；96孔板(corning，美国)；二氧化碳培养箱 (Verco 公司，美国)；倒置显微镜(Nikon公司，日本)；紫外分光光度计Nanodrop(Thermo公司，美国)；Odyssey红外荧光扫描仪(LICOR，美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和ERS模型建立

NSC34细胞用DMEM培养基于5%CO2、37 ℃的培养箱内培养，每2 d换1次培养液；传代时用0.25%胰酶消化1 min，倒置显微镜观察细胞生长情况，取对数生长期细胞进行实验。根据不同浓度TM对NSC34细胞系细胞活力影响的不同，我们选择TM 2.5 mg/mL作用到NSC34细胞系，构建运动神经元的ERS模型，再加入GA(5.0 μM)，观察GA对NSC34细胞系的ERS模型是否具有保护作用。

1.2.2 细胞分组

NSC34细胞分为衣霉素NSC34空白对照组(Vehicle组)、TM(Tunicamycin)组和TM+GA组；TM组：NSC34细胞均匀铺板后24 h加入不同浓度TM，浓度为0.5、1.25、2.5、5、10 μM，在24hMTT检测细胞活力；TM+GA组：NSC34细胞均匀铺板后24 h加入TM，终浓度为2.5 μM，同时加入不同浓度的GA，终浓度为0.25、0.5、1.25、2.5、5.0、7.5、12.5、25 μM，24 h后MTT检测细胞活力。

hSOD1 G93A NSC34细胞系对照组和hSOD1 G93A NSC34细胞系+GA组，24 h后用Western blot方法检测外源性SOD1 G93A蛋白以及内源性mouse SOD1蛋白表达量。

1.2.3 MTT检测

首先称取适量MTT粉末，应用PBS对其进行溶解，配制成浓度为5 mg/mL的MTT溶液，用1.5 mL离心管分装，避光-20 ℃保存备用；待检测96孔板中贴壁细胞活力时每孔加入20 μL MTT溶液，同时设置调零孔及对照孔，5% CO2、37 ℃细胞培养箱中孵育4 h，弃去孔内液体；每孔加入150 μL DMSO，避光条件下轻微振荡10 min；通过酶联免疫检测仪(波长490 nm)测量各孔的吸光值，根据公式计算出细胞活力。细胞活力计算公式：细胞活力(%)=[A(加药孔)-A(调零孔)]/[A(对照孔)-A(调零孔)]×100%

1.2.4 Western Blot检测

弃掉培养瓶中细胞培养液，使用预冷的0.01 M PBS洗涤细胞3次，加100 μL的裂解液，冰上裂解30 min；在冰上用细胞刮迅速刮下培养瓶中的细胞，用移液器将细胞裂解悬液移至1.5 mL离心管中，涡旋数秒钟，12 000 r/min 4 ℃离心20 min；吸取上清液，BCA法检测蛋白浓度；10%SDS-PAGE电泳分离，硝酸纤维素膜转膜，5%BSA中37 ℃摇床封闭2 h；将硝酸纤维素膜放入Anti -eIF2α(1∶1 000)抗体、Anti-P-eIF2α(1∶1 000)抗体、Anti-actin(1∶1 000)抗体、Anti-SOD1抗体(1∶200) 的一抗溶液中，4 ℃过夜；PBST洗膜后置于相应种属的红外二抗中(1∶8 000)，避光室温摇床孵育1 h；用PBST漂洗膜10 min×3次后用Odyssey扫膜仪扫膜，并应用Image J软件分析条带的光密度值。

1.2.5 统计学处理

所有数据用均数±标准误(mean±SEM)表示，采用SPSS20.0统计软件，多组间比较应用单因素方差分析(One-way ANOVA)，多重组间比较采用SNK-q检验。各种检验的显著性水平设定为P<0.05。

2 结 果

2.1 GA对NSC34细胞系ERS模型的影响

2.1.1 不同浓度TM对NSC34细胞系细胞活力的影响

不同浓度TM对该细胞都有一定的损伤作用(P<0.05)，但是不同浓度对细胞活力的影响并不明显(P>0.05)(图1)。

图1 TM作用NSC34细胞24h后对细胞活力的影响 与空白对照组比较,*P<0.05

2.1.2 显微镜下观察GA对TM作用到NSC34细胞系24 h细胞数的影响

通过显微镜观察可以发现TM+GA组细胞数较TM对照组增多(图2)。

2.1.3 MTT方法检测GA对NSC34细胞系ERS模型细胞活力的影响

多个浓度GA对TM在NSC34细胞系中所致的ERS模型具有明显的保护作用，可以提高细胞活力(P<0.05)(图3)。

图2 显微镜下观察GA对TM作用24h细胞数量的影响 TM+GA组细胞数较TM对照组增多(scalebar=200μm)

图3 GA与TM共同作用24h细胞活力的变化 与空白对照组、TM+GA0.25μm组及TM+GA0.75μm组比较,*P<0.05

2.1.4 用Western Blot方法检测TM、GA对NSC34细胞系ERS蛋白eIF2α和P-eIF2α的影响

TM组与对照组比较，P-eIF2α表达量均明显降低(P<0.05)，证实TM可以成功诱导NSC34的ERS模型，而TM+GA组与TM组比较发现，GA能够增加P-eIF2α的表达量(P<0.05)，但并不影响总eIF2α的含量(P>0.05)(图4)。

2.2 GA对SOD1 G93A NSC34细胞系SOD1蛋白表达的影响

2.2.1 通过慢病毒转染的方法成功构建SOD1 G93A NSC34细胞系

通过慢病毒(Lentiviral)载体携带 Puromycin与 GFP 共表达；通过加嘌呤霉素进行稳转细胞系筛选。成功构建稳定转染的SOD1 G93A NSC34细胞系(图5)。

图4 TM、GA对NSC34细胞系ERS相关蛋白P-eIF2α的影响 A为Vehicle组、TM组、TM+GA组ERS相关蛋白表达量的变化;B为对ERS相关蛋白表达量比较,与TM组P-eIF2α表达量比较,*P<0.05

图5 稳定转染的SOD1G93ANSC34细胞系GFP荧光图片(scalebar=200μm)

2.2.2 GA在SOD1 G93A NSC34细胞系中可以减少外源性mSOD1蛋白的表达量

GA主要减少外源性SOD1 G93A蛋白的表达量(P<0.05)，而对内源性的mouse SOD1蛋白表达没有明显影响(P>0.05)(图6)。

3 讨 论

肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种致死性神经系统变性病，它的确切发病机制尚不清楚，可能与SOD1基因突变等机制有关。近年来越来越多的研究表明ERS参与了ALS的发病机制，逐渐成为ALS研究领域的热点[12]。基于ERS机制，通过抑制P-eIF2α的去磷酸化减轻ERS对ALS可能起到保护治疗作用。胍那苄(guanabenz，GA)是一种中枢系统α-2受体激动剂[13]，而最新研究发现它也是一种P-eIF2α去磷酸化抑制剂，它能够选择性的与PP1的亚基GADD34结合，抑制P-eIF2α去磷酸化，从而减少异常蛋白的合成，起到抑制ERS的作用[11]。GA只是抑制应激状态下蛋白质的合成，对基本蛋白质的合成没有影响。

图6 GA对外源性hSOD1G93A蛋白以及内源性mouseSOD1蛋白表达量的影响 与Vehicle组比较,#P<0.05

NSC34细胞系是运动神经元样细胞系，它同时具有了运动神经元的特征和肿瘤细胞可以传代的特征。TM可以引起错误折叠蛋白在内质网内积聚，从而诱发ERS。本研究将TM加入到NSC34细胞系中可以明显减少细胞数，引起ERS相关蛋白P-eIF2α表达量下降，成功制造出运动神经元的ERS模型；在此基础上再加入不同浓度的GA，应用MTT方法检测细胞活力的变化，研究结果显示GA组细胞数较TM对照组明显增多，GA可能通过增加P-eIF2α而对TM在NSC34细胞系中所致的ERS模型具有明显的保护作用，可以明显提高细胞活力。这与Tsaytler[11]等的研究结果一致，证明GA在运动神经元的ERS模型中也可以起到保护作用。

mSOD1蛋白的异常沉积是造成ALS产生ERS的原因[14]，因此如果能够减少mSOD1蛋白的表达量则可能起到抑制ERS的作用。本研究应用慢病毒携带GFP转染的方法成功制造了稳定转染的SOD1 G93A NSC34细胞系，它的转染效率高，成功转染的细胞比例高，因此是研究ALS理想的细胞模型。转染的质粒是hSOD1 G93A，这与动物模型一致。hSOD1 G93A蛋白的分子量为21 KD，而小鼠SOD1(mouse SOD1)分子量为17KD。本研究在SOD1 G93A NSC34细胞系中加入GA(5 μM)，通过Western blot方法检测到hSOD1 G93A蛋白的表达量明显减少，而对内源性的mouse SOD1蛋白没有影响。这说明GA只是对应激状态下产生的异常蛋白起到抑制翻译的作用，而对正常的基本功能蛋白没有明显的影响。

我们的前期研究发现胍那苄(guanabenz，GA)作为P-eIF2α去磷酸化抑制剂，可以延长ALS转基因小鼠的生存期，延缓发病时间及运动功能减退。本研究以NSC34的ERS模型和SOD1 G93A NSC34细胞系为ALS模型，研究GA对神经元ERS模型以及ALS细胞模型的作用，本研究结果表明GA可能通过增加P-eIF2α的表达量而增强NSC34细胞ERS模型的细胞活力；在SOD1 G93A NSC34细胞系中可以减少外源性hSOD1 G93A的表达量。综上所述，GA有可能成为治疗ALS的新药物。

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(2016-09-06收稿 2016-10-07修回)

Protective effect of guanabenz in endoplasmic reticulum stress model of mouse motor neuron-like hybrid cell line

Jiang Hongquan,Feng Honglin,Sun Xiaojia.

Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001

Objective To explore the protective effect of guanabenz(GA),a novel inhibitor of eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α) dephosphorylation,in endoplasmic reticulum stress (ERS) model of mouse motor neuron-like hybrid cell line(NSC34),and determine whether it could decrease the expression of exogenous hSOD1 G93A protein.Methods (1) Tunicamycin (TM) was used to stress NSC34 to produce ERS model.We tested the cell’s number and viability of NSC34 treated with different concentrations of GA by microscope and MTT test.The expression of phosphorylated-eIF2α (P-eIF2α) and eIF2α was detected by western blot in Vehicle,TM and TM+GA groups.( 2) hSOD1 G93A was transfected into NSC34 with lentiviral.The expression of hSOD1 G93A and mouse SOD1 was detected by Western blot in hSOD1 G93A NSC34 treated with or without GA.Results GA increased the cell’s number and viability of NSC34 treated with different concentrations of GA compared with control group(P<0.05).Western blot results revealed that GA dramatically increased the level of P-eIF2α protein,without affecting total eIF2α protein level.The exogenous hSOD1 G93A protein was decreased by GA,but the expression of mouse endogenous SOD1 was not affected.Conclusion GA can protect the ERS model of NSC34 through increasing the expression of P-eIF2α protein.GA can decrease insoluble mutant SOD1 aggregates.

Neurodegenerative disease Amyotrophic lateral sclerosis Endoplasmic reticulum stress Guanabenz SOD1

黑龙江省教育厅科学技术研究项目资助(编号为12541472)

150001 哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科疑难病科[姜宏佺 丰宏林(通信作者) 孙晓嘉]

R741

A

1007-0478(2017)03-0173-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.03.001