类黄酮对人体外周血破骨细胞分化p38MAPK/c-Fos信号通路调控的研究

王想福 孙凤歧* 叶丙霖 范有福 李盛华 温少瑾

1.甘肃省中医院脊柱微创骨科，甘肃 兰州 730050 2.甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050

类黄酮是自然黄酮的类似物，在体内实验中，它可以抑制破骨细胞引起的骨吸收。在体外实验中，它可以抑制破骨细胞的形成和骨吸收。在一些国家，类黄酮被用来治疗骨质疏松。

骨质疏松症是一种常见的、全身性的骨代谢疾病，其特征是骨量减少、骨组织微结构退化，导致骨脆性增加从而引起腰背疼痛、骨密度下降、骨折等常见症状，并会发生身长缩短、驼背等。骨质疏松导致代谢紊乱，从而造成血钙偏高，由此引起一系列与钙代谢紊乱相关的并发症，如高血压、冠心病、动脉硬化及脑血管疾病等[1]。国内学者调查发现，我国50岁以上骨质疏松约有6 944万人，40岁以上汉族人群骨质疏松症患病率为12.4%，并且女性明显多于男性[2-3]。国外部分学者调查发现，美国每年有2 500万骨质疏松症患者，其中因骨质疏松导致骨折约为150万人，约占6%[1]，而我国每年因骨质疏松症导致骨折的人数却高于10%。因此，骨质疏松的治疗已成为亟待解决的社会问题。鉴于目前西药治疗的费用高、疗程长、不良反应较多等弊端，大力发展其他疗法治疗该病显得尤为重要。

类黄酮是一种广泛存在于自然界中的酚类物质，作为一种植物次生代谢产物，广泛存在于多种植物中[4]。大量动物实验证实类黄酮可以抑制骨细胞的吸收，促进骨生成[5]。因而增加对类黄酮的认识可对骨质疏松的治疗起到重要作用。本研究观察了类黄酮对体外培养破骨细胞的影响，从而更加了解类黄酮对骨质疏松治疗的作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

培养基 MEM，临用时加10%小牛血清(NBS，Gibco BR)；消化酶(0.25%胰蛋白酶，0.1%Ⅱ型胶原酶，Sigma公司)；类黄酮(上海迪奥生物科技有限公司)；D-Hanks液(美国Hyclone公司)；人重组RANKL蛋白和M-CSF蛋白；2.5%戊二醛固定液；青链霉素双抗、淋巴细胞分离液等。

1.2 主要仪器及器械

二氧化碳培养箱，德国；纯水系统，美国；电子天平，上海；超洁净工作台，苏州；倒置相差显微镜 Olympus EX70，日本；光学显微摄影系统 Nikon E600型，日本；磁力搅拌器，上海；微量移液器，上海；RT-PCR 仪：LineGene 9600，杭州；低温台式高速离心机，上海；引物合成，上海生工。

1.3 试验对象

健康志愿者外周血，所有志愿者均签署伦理知情同意书。

1.4 细胞的培养

1.4.1体外破骨细胞诱导模型的复制：抽取健康志愿者外周血液共计13 mL，其中3 mL用于血常规检查，将另外10 mL外周血加入50 mL离心管，并加入等体积的D-hanks液，混合均匀。取4 mL淋巴细胞分离液(室温)加入15 mL无菌离心管，加入上述混合均匀的血液8 mL置于淋巴细胞分离页面上，离心并吸取含有单个核细胞的白膜层，再加入5倍体积D-hanks液，洗涤并充分离心，细胞沉淀中加入1 mL含10%FBS的培养基，吹打均匀并计数细胞，预留活细胞率>95%，细胞数>107个的细胞悬浮液进入下一步纯化。利用RANKL、M-CSF诱导单个核细胞向破骨细胞分化。接种单个核细胞并置于5%二氧化碳培养箱培养48 h。将冲洗并收集的离心并用MEM洗涤2次，并将细胞沉淀中加入1 mL含10% FBS及100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素的培养基，吹打并计数，预留活细胞率>95%，细胞数>107个的细胞悬浮液进入下一步培养。将上述细胞调整为107个/mL细胞悬液，分别加入RANKL和M-CSF的两个体系，及时换液，铺有细胞的骨片转移至新孔培养，进行TRAP染色。双蒸水轻柔漂洗2次，加入100 μL苏木素复染2 min，再次用双蒸水冲洗细胞核为蓝色，干燥后采用荧光倒置显微镜观察，摄像。取出骨片PBS冲洗，2.5%戊二醛固定10 min，再次PBS冲洗，去离子水超声冲洗3 min×3次，酒精脱干并甲苯胺蓝染色20 s，PBS冲洗，干燥再进行骨吸收陷窝染色观察。

1.4.2类黄酮调控：根据上述方法获得破骨细胞，并分为对照组(10%FBS+MEM+100 U青霉素+100 μg/mL链霉素+30 ng/mL RANKL、25 ng/mL M-CSF)和干预组(10%FBS+MEM+100 U青霉素+100 μg/mL链霉素+30 ng/mL RANKL、25 ng/mL M-CSF+0.5 μg/mL类黄酮)，将最终培养得到的细胞进行镜下观察破骨细胞活性。提取RNA(均为冰上操作)，分别进行匀浆、分相、沉淀、清洗、溶解、RNA定量及纯度检测、逆转录。PCR所需引物均由上海生工合成，以人β-actin作为内参对照，进行凝胶电影检测模板，进行RT-PCR，每个反应孔15 μL体系，每个基因3个复孔，每组均设阴性对照。并进行Western blot检测，具体步骤如下：收集DATS处理后的OCs细胞，冷PBS洗2次后，加入适量的细胞裂解缓冲液，于4 ℃裂解1 h，10000 rpm×10 min，吸取上清液，即为细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量。调节每份样品浓度，以等量的蛋白量加样，样品加入1∶4的5×SDS加样缓冲液，沸水煮沸5 min，经10%SDS-PAGE胶电泳分离，然后转至PVDF膜上，膜用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗(封闭液1∶200～1∶1000稀释)，室温孵育2 h；TBST洗3次，每次10 min；加相应的辣根过氧化物酶连接的抗兔的二抗(封闭液1∶2000稀释)，室温孵育1 h；TBST洗3次，每次15 min；用ECL发光法检测不同蛋白表达状况；薄层扫描仪测定印迹区带的光密度值。

1.5 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件对各组样本均数行t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 类黄酮对干预组和对照组破骨细胞的活性影响

细胞形态学观察可见诱导培养的破骨细胞形态明显，干预组破骨细胞样细胞的形成减少，活性减弱，两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 类黄酮对体外培养的破骨细胞活性影响。A：对照组(×10)；B：干预组(×10)Fig.1 Effect of flavonoids on osteoclast activity in vitro. A: Control group (×10); B: Intervention group (×10)

2.2 RT-PCR检测c-fos基因表达量结果

采用RT-PCR技术，对干预组破骨细胞中c-fos mRNA水平进行了检测，见图2。由图2可见，检测物质的溶解曲线较好，无非特异性杂带。与对照组比较，类黄酮作用的干预组c-fos的mRNA表达水平较对照组降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

图2 c-fos mRNA量化结果注：与干预组比较，**P<0.01Fig.2 Results of c-fos mRNA quantization.Note: Compared with the intervention group, **P<0.01.

2.3 采用Western blot检测p38蛋白表达水平

Western blot检测结果显示干预组p-p38蛋白表达水平较对照组降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3、4。

图3 p-p38/p38检测结果对比注：以p38为内参，干预组p-p38表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)Fig.3 Comparison of p-p38/p38 test results.Note: Using p38 as internal control, p-p38 expression in the intervention group decreased, and the difference was statistically significant (P<0.05).

图4 p-p38/p38量化结果注：与干预组比较，**P<0.05Fig.4 Results of p-p38/p38 quantizationNote: Compared with the intervention group, **P<0.05.

3 讨论

类黄酮因其色泽多呈黄色而被冠以此名，它是一大类常见的多酚化合物，目前已发现的天然类黄酮有4000多种，类黄酮是一类具有广泛生物活性的植物次生代谢物，其在人体内作用机制比较复杂，类黄酮多存在于淫羊藿、花、茶叶、豆类、蔬菜、水果等多种食源性植物中。近年来不断深入的研究发现，类黄酮具有减弱破骨细胞活性、促进成骨细胞增殖、分化、矿化促进骨形成，并且具有良好的抗氧化、抑制脂质过氧化反应、预防心血管疾病、抗癌等生物活性[6-9]。

骨质疏松引起的各种疾病严重影响中老年人尤其是绝经后妇女的生活质量，加上医疗费用支出的增多、寿命的缩短等不仅对患者的身心健康造成危害，也增加了家庭和社会的经济负担，已被公认为仅次于心血管疾病的第2大健康杀手，成为极为严重的公共健康问题。因此，骨质疏松作为一种常见的代谢性骨骼疾病，常见的疾病好发因素包括老化、炎症性肠病、甲亢以及药物引起等。根据2014年我国骨质疏松诊断标准专家共识，目前国内骨质疏松患者人数仍有逐年增多趋势，严重威胁着人类的健康。

类黄酮的作用主要包括防治骨质疏松、抑制血小板聚集、止血与镇痛、抑菌、抗炎、抗风湿、保肝、抗氧化及抗癌作用，类黄酮通过对人体外周血p38MAPK/c-fos信号通路的调控来抑制破骨细胞分化。其中 p38MAPK通路主要参与破骨细胞的生成和凋亡，但是还缺少有关作用机制的研究，更缺少随机对照的大样本临床研究[10-11]。近年关于类黄酮治疗骨质疏松的研究层出不穷，越来越多的证据表明类黄酮对于骨质疏松的治疗具有确切的疗效。部分学者在细胞和动物实验中发现类黄酮能够通过多种途径促进成骨细胞生成，抑制破骨细胞分化，进而能够在机体雌激素缺乏时尽量减少骨质的丢失，以至提高骨密度和骨矿含量，但是具体作用机制尚不完全清楚。Ailsa等[12]研究认为，类黄酮可能是通过减少氧化应激或慢性低度炎症信号通路的影响，从而达到防止骨质流失的作用。部分学者赞同上述观点，并且通过实验研究初步证实类黄酮可以减少维生素A的应激氧化，并且能够阻滞维甲酸和磷的含量以防骨质的流失[13]。

类黄酮在人体内作用机制比较复杂[14]，本研究虽然发现类黄酮在人体外周血破骨细胞分化p38MAPK/c-fos信号通路调控中起作用，但是目前实验过程由于不可控因素较多，尚缺乏有效证据表明类黄酮对于人体骨质疏松的治疗效果。因此，类黄酮发挥治疗骨质疏松的具体机制尚未完全阐明，进一步的研究将有助于认识该药物的治疗作用机制，从而为类黄酮大量的投入应用于临床奠定一定的理论基础[15-16]。类黄酮对人体外周血破骨细胞分化机制还不是十分清楚，还有待大规模、多中心随机对照实验研究。