丹参酮ⅡA对生长期大鼠骨密度及骨形态计量学影响的研究

杨芳芳 高玉海 葸慧荣 陈克明 马慧萍

1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000 2.兰州军区总医院药剂科，甘肃 兰州 730050 3.兰州军区总医院骨科研究所，甘肃 兰州 730050

随着老龄化社会的到来，骨质疏松症(osteoporosis，OP)的发生率逐年上升，对人类生活质量和身体健康带来了严重的威胁。目前临床治疗OP的化学合成药物具有一定疗效，但都有较大的不良反应[1]。我国清代王清任所著《医林改错》指出，“血液瘀滞，经脉不畅，水谷精微得不到布散，不仅脏腑因濡养不足而衰弱，骨髓也因此不得充润……”，提示我们从活血化瘀的角度也有可能防治OP。蔡辉等[2]认为活血化瘀中药在治疗骨质疏松症上呈现出多靶点、多环节、多通路、效果明显、毒副作用少等特点。因此探索活血中药预防与治疗骨质疏松症无疑具有潜在价值。丹参酮ⅡA是活血化瘀中药丹参中的主要有效成分之一，实验研究表明丹参酮ⅡA能提高体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)增殖速率，对BMSCs向成骨细胞分化有明确的诱导作用[3]。本实验研究了口服丹参酮ⅡA对生长期大鼠骨密度和骨质量的影响，以初步探讨用活血化瘀药物预防骨质疏松症的可行性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

丹参酮ⅡA(陕西宝鸡辰光生物科技有限公司，批号：20150816)；淫羊藿苷(陕西宝鸡辰光生物科技有限公司，批号：20150125)；10%水合氯醛(天津市光复精细化工研究所)；双能X射线骨密度仪(Lunar Prodigy, GE 公司，美国)；骨形成指标降钙素检测试剂盒和骨吸收指标TRAP5b检测试剂盒(Rat-MIDTM Osteocalcin EIA和Rat TRAPTMELISA，IDS公司，丹麦)；SP1600硬组织切片机(LEICA公司，德国)；正置荧光显微镜(BX51，Olympus，日本)；酶标仪(Epoch, BioTek公司，美国)。

1.2 实验对象

1月龄Wistar雌性大鼠30只，体重(95±3)g，由甘肃中医药大学实验动物中心提供(合格证号：SCXK(甘)2011-0001)，大鼠饲养于 SPF 级实验室，自由饮水(自来水)和进食。

1.3 研究方法

1.3.1分组和给药：实验大鼠随机分3组，每组10只，分别为丹参酮ⅡA组、淫羊藿苷组(阳性对照)和正常对照组。丹参酮ⅡA用蒸馏水配成 1.1 mg/mL的混悬液，按每只大鼠 11 mg/(kg·d)给药；淫羊藿苷配成2.5 mg/mL的混悬液，按每只大鼠 25 mg/(kg·d)给药；正常对照组灌服相同体积蒸馏水。每两周称一次体重。

1.3.2骨密度的测定：一个月测1次全身骨密度，检测前先腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉，待检测到用药组与对照组间有显著性差异后即处死所有实验动物，剥离椎骨、双侧股骨和胫骨，并保存于10%多聚甲醛中，测定椎骨和左侧股骨骨密度。

1.3.3骨形态计量分析：将右侧胫骨从10%多聚甲醛中取出。依次进行脱水、包埋、切片，再用1200、1500、2000目的砂纸均匀打磨至半透明，用品红-苦味酸进行染色。镜下观察骨组织形态结构，用IPP 6.0软件分析骨小梁相关参数，并观察骨组织形态结构。

1.3.4测定血清生化指标：大鼠麻醉后，腹腔动脉取血，以5 000 r/min转速离心10 min，取血清置于-80 ℃冰箱保存；按 ELISA试剂盒说明书步骤测定血清中TRACP 5b和骨钙素(osteocalcin，OC)含量，绘制标准曲线，测定405 nm和450 nm处吸光值，计算含量。

2 结果

2个月后，各组实验大鼠的存活率都是90%。

2.1 大鼠体重变化情况

3组大鼠的体重在实验期间始终无明显差异，丹参酮ⅡA组在第9周的体重略有下降，但与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。说明丹参酮ⅡA灌胃对大鼠体重无明显影响。

图1 大鼠体重测定结果Fig.1 The results of body weight in rats

2.2 大鼠骨密度测定结果

3组大鼠在第1个月的全身骨密度检查结果虽有差异，但并无统计学意义(图2)。第2个月的检查结果见图2，可以看到，与对照组相比，丹参酮ⅡA组和淫羊藿苷组的全身骨密度显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而丹参酮ⅡA和淫羊藿苷组之间差异没有统计学意义。大鼠处死后的离体骨密度检测结果见图3，可见丹参酮ⅡA组离体股骨骨密度极显著高于对照组(P<0.01)，离体椎骨骨密度显著高于对照组(P<0.05)；丹参酮ⅡA组和淫羊藿苷组之间差异没有统计学意义，说明丹参酮ⅡA能有效提高大鼠全身和离体骨密度。

图4 大鼠胫骨近心干骺端骨组织形态学变化(40×，标尺=1 000 μm)。A：对照组；B：淫羊藿苷组；C：丹参酮ⅡA组Fig.4 Morphology of the proximal metaphysis of the tibia (40×, ruler=1 000 μm). A: Control group; B: Icariin group; C: Tanshinone II A group.

图2 大鼠全身骨密度值测定结果注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。Fig.2 The results of the whole-body bone mineral density in ratsNote: Compared with the control group, *P<0.05，**P<0.01.

图3 大鼠离体骨密度测定结果注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。Fig.3 The results of bone mineral density ex vivoNote: Compared with the control group, *P<0.05，**P<0.01.

2.3 骨形态计量学分析结果

由图4可知，丹参酮ⅡA组和淫羊藿苷组胫骨骨组织的网状结构较对照组致密，量化分析结果显示(表1)，丹参酮ⅡA组和淫羊藿苷组的骨小梁数目、骨小梁宽度和骨小梁面积百分比显著高于对照组(P<0.05)，而骨小梁分离度显著低于对照组(P<0.05)。说明可以改善松质骨的微结构，提高骨质量，见表1。

2.4 血清骨代谢指标检测结果

与对照组相比，给药组均能显著提高大鼠血清中OC的含量(P<0.05)，同时显著降低血清中TRACP 5b的含量(P<0.05)。说明丹参酮ⅡA促进骨形成和抑制骨吸收的双重活性来提高骨密度和改善骨的微结构，见表2。

表1 各组大鼠胫骨近心干骺端组织计量学静态参数Table 1 Histomorphometric indices in the proximal tibia metaphysis of rats

注：与对照组相比，*P<0.05。

表2 各组大鼠血清骨钙素和抗酒石酸酸性磷酸酶的测定结果Table 2 The results of serum OC and TRACP

注：与对照组相比，*P<0.05。

3 讨论

现代医学证明，骨的微循环和血流变功能失衡必然会导致骨细胞的能量代谢发生紊乱，造成骨骼的微结构发生血液瘀滞，久而久之，骨小梁数目减少、强度降低，从而造成微骨折[4]。关于活血化瘀中药治疗骨质疏松症的研究颇多，并发现其具有重要作用[5]。药理学研究也表明，丹参酮ⅡA具有抗氧化、抗凝血、扩张血管、改变血液粘滞性、加快血液循环、改善微循环、增加心肌供血、抗菌消炎、抗肿瘤等作用[6]。这些功效与活血化瘀治疗骨质疏松症的理论相符合。可见用活血化瘀理论治疗骨质疏松症是一种有效的方法。此外，莫朝伦等[7]研究发现丹参酮ⅡA在一定的作用时间内，对体外培养的成骨细胞(osteoblast，OB)具有促增殖分化的作用。叶茂等[8]也发现丹参酮ⅡA能促进成骨细胞增殖，其机制可能是通过抑制成骨细胞的凋亡。还有研究表明其对体外培养破骨细胞具有抑制作用[9-10]，并能抑制骨吸收及降低骨转换率以延缓或阻断绝经后快速骨丢失[11]，能防止去卵巢大鼠腰椎和胫骨松质骨的丢失[12]。此外，丹参酮可以防止以维甲酸诱导的大鼠骨质疏松模型的骨丢失，其机制可能与提高激素水平、抑制骨高转换有关[13]。目前，尚未发现国内外关于丹参酮ⅡA提高动物峰值骨量的研究，因此，此研究为开发预防与治疗骨质疏松症中药单体新药奠定了基础。

有大量研究表明口服淫羊藿苷可通过抑制骨吸收而促进骨形成，提高大鼠的峰值骨密度和骨质量[14-15]，金雀异黄酮是公认的治疗骨质疏松症疗效的药物[16]，而口服淫羊藿苷与金雀异黄酮的对比研究显示[17]，淫羊藿苷提高骨密度的能力强于金雀异黄酮，而且对骨硬度的提高能力具有同样的表现，此研究并将金雀异黄酮药物浓度(10 mg/kg)通过分子量换算成同样摩尔浓度的淫羊藿苷(即 25 mg/kg)。因此，将淫羊藿苷作为此研究的阳性对照，并将丹参酮ⅡA的口服剂量用其同样的方法换算，即为11 mg/kg。

本实验研究结果显示，灌服丹参酮ⅡA两个月后，大鼠全身骨密度和离体骨密度都显著增加，同时胫骨近端骨小梁的数量和宽度显著增加，骨小梁分离度却显著减小，表明骨小梁的致密程度明显增加。血清骨代谢指标检测结果表明，大鼠的骨形成指标增加而骨吸收指标下降，表明丹参酮ⅡA可能是通过提高骨形成和抑制骨吸收而影响骨代谢，最终导致骨密度增加，骨质量明显提高。上述结果表明，丹参酮ⅡA可以通过提高峰值骨量而达到预防老年性或绝经后骨质疏松的效果，具有开发抗骨质疏松新药或先导化合物的潜在价值。