汉黄芩素通过激活活性氧簇介导的p38MAPK信号通路诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡

王慧莲 孟庆良 李松伟 王济华

1. 河南省中医院风湿病科，河南 郑州 450000 2. 河南中医药大学第一附属医院风湿病科，河南 郑州 450000

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫疾病，主要病理表现为炎症的反复发作、滑膜组织过度增殖和功能异常，最终引起关节纤维化和关节功能障碍[1]。已经证实成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)可表现出转化细胞的特征，呈类肿瘤细胞样异常增殖，侵入到软骨和软骨下的骨质，并产生炎性介质、分泌基质金属蛋白酶等，其过度增殖在RA的发病过程中起到了重要作用[2-3]。因此，诱导人成纤维样滑膜细胞的凋亡是治疗RA的主要靶点。目前临床上多采用甲氨蝶呤、环磷酰胺等抗肿瘤药物治疗RA患者，虽然疗效明显，但都有不良反应多或价格昂贵等缺点，增加了患者的痛苦和经济负担[4]。本研究从中医中药的角度研究汉黄芩素对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes，RA-FLS)凋亡的影响，探讨汉黄芩素对RA潜在的治疗作用。

1 材料和方法

1.1 样本与试剂

采集2015年6至12月河南省中医院风湿科收治的7例RA患者关节积液标本，其中男4例、女3例；年龄38～62岁，平均55.7岁。入选标准：确诊诊断均符合2010年ACR/EULR分类标准。排除标准：①合并感染者；②伴随慢性心、肝、肾功能不全者；③合并其他自身免疫性疾病者；④合并冠心病患者；⑤合并血液系统疾病患者。所有患者均签署知情同意书。体外原代培养人成纤维样滑膜细胞。

DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶均购自美国Gibco公司，四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、DCFH-DA和罗丹明123荧光染料购自美国Sigma公司，Annexin V/FITC 细胞凋亡试剂盒和活性氧清除剂(NAC)购自上海碧云天生物技术研究所，p38MAPK抑制剂 (SB203580)购于美国Calbiochem公司，汉黄芩素购自南京郎泽医药科技有限公司(纯度大于98.0%)，p-p38MAPK、p38MAPK及β-actin 的单克隆抗体及辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗购于美国Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 成纤维样滑膜细胞的分离与培养

无菌采集患者关节腔积液30 mL，1000 r/min 离心10 min，弃上清后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)重悬沉淀，经100目筛网过滤，将滤液以1000 r/min 离心10 min，再以PBS清洗沉淀2次后，用含有10%的胎牛血清及青霉素和链霉素各100U的DMEM 培养基重悬细胞，用计数板计数细胞。将收集的细胞接种于25 cm2的培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养。12 h更换一次培养液，去除非贴壁细胞，重复2～3次。3 d后倒置显微镜下观察，细胞呈梭状成纤维样。用胰蛋白酶法收集滑膜细胞，按细胞密度5×105个/L复种于25 cm2塑料培养瓶中。后续用于实验的细胞为3～5代生长稳定的成纤维样滑膜细胞。

1.3 细胞处理与分组

将纯化培养的成纤维样滑膜细胞按照1×103个/L接种于平底48孔板中，待细胞生长至80%时进行处理并分组。(1)正常对照组：不加任何药物处理，常规培养；(2)低剂量汉黄芩素组：加入汉黄芩素使其终浓度为20 μg/mL；(3)中剂量汉黄芩素组：加入汉黄芩素使其终浓度为50 μg/mL；(4)高剂量汉黄芩素组：加入汉黄芩素使其终浓度为100 μg/mL；(5)100 μg/mL汉黄芩素+ N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)组：细胞先加入终浓度为5 mmol/L活性氧的清除剂NAC处理12 h，然后再加入汉黄芩素，使其终浓度为100 μg/mL；(6)100 μg/mL汉黄芩素+SB203580组：细胞先加入终浓度为10 μmol/L p38MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)抑制剂SB203580处理12 h，再加入汉黄芩素使其终浓度为100 μg/mL。

1.4 MTT法检测细胞增殖

取待测组对数生长期的细胞，调整细胞浓度以5×104个/mL接种于96孔板中，同时设定阴性对照孔(即不加细胞按照同步骤处理)，各自培养24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT20 μL，继续培养4 h，弃掉上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，室温振荡10 min，在酶标仪上检测490 nm处吸光度[光密度(optical delnsity，OD)值]。每组同时设置5个重复孔。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

调整待测组细胞浓度为1×106个/mL，取200 μL 细胞悬液，FITC标记的Annexin-V和PI各5 μL 混匀后避光孵育20 min，低速离心收集细胞，150 μL PBS重悬细胞，用流式细胞检测仪上样检测各组成纤维样滑膜细胞凋亡率。

1.6 细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)含量的测定

Rh123是一种可被线粒体吸收的绿色荧光染料，其吸收值随细胞MMP的改变而变化，因此本实验根据荧光强度来间接反映MMP的高低。将100 μL待测组细胞接种于6孔培养板中，细胞生长融合至80%时，弃掉培养液，PBS清洗3次，加入10 μg/L Rh123于37 ℃避光孵育45 min，再用PBS冲洗3次。在荧光显微镜下随机选择3个不同区观察其荧光，并用ImageJ 1.41软件分析各视野下平均荧光强度，对各组细胞的每个样本进行统计学分析。

1.7 细胞内活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)含量的检测

DCFH-DA能够自由通过细胞膜，被细胞内的ROS氧化成有荧光的DCF，本研究通过观察DCF的荧光强度分析细胞内ROS的水平。将100 μL待测组细胞接种于6孔培养板中，细胞生长融合至80%时，弃掉培养液，PBS清洗3次，加入10 μmol/L DCFH-DA于37 ℃避光孵育30 min，再用PBS冲洗3次。在荧光显微镜下随机选择3个不同区观察其荧光，并用ImageJ 1.41软件分析各视野下平均荧光强度，对各组细胞的每个样本进行统计学分析。

1.8 Western blot分析p38MAPK相关蛋白的表达

收获待测组细胞，加裂解液提取蛋白，BCA 法进行总蛋白定量。调整上样量为25 μg总蛋白/样本，上样，电泳，转膜，封闭过夜。封闭完毕后PBS 洗膜5次，分别加一抗(所用的一抗稀释比例分别为p-p38MAPK抗体11000、p38MAPK抗体11000)，37 ℃反应1.5 h，PBS洗膜5次，加辣根过氧化物酶标记二抗，37 ℃反应1 h，PBS洗膜5次。染色，曝光，采用BIORAD GELDOC XR 凝胶成像系统依次显影、定影，Quantity One Basic 软件分析胶片蛋白条带。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 细胞培养结果

7例患者的关节滑液经处理后均成功获得大量成纤维样细胞，经鉴定该细胞为CD68阴性细胞，即人成纤维样滑膜细胞。经过反复贴壁与传代3代后，细胞纯度达到90%以上，体外生长稳定，显微镜下观察细胞形态基本为长梭形，胞质透亮、均匀，细胞轮廓清晰，适合后续实验(见图1)。

图1 光镜下成纤维样滑膜细胞形态观察(×200)Fig.1 Morphology of RA-FLS under light microscope (×200)

2.2 汉黄芩素抑制RA-FLS细胞增殖

与正常对照组相比，不同浓度汉黄芩素处理后RA-FLS细胞各个时间点在490 nm下OD值均明显减少，并且呈现剂量依赖性关系，差异具有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

2.3 汉黄芩素诱导RA-FLS细胞凋亡

与正常对照组细胞凋亡率(7.69±1.46)%比较，从低剂量到高剂量汉黄芩素处理组细胞凋亡率依次为(12.32±1.65)%、(15.89±2.17)%和(19.16±2.13)%，组间差异具有统计学意义(P<0.05)(见图2)。

表1 MTT法检测各组细胞的增殖(OD值，Table 1 Proliferation of RA-FLS in each group detected with MTT assay (OD Value,

注：与正常对照组相比，*P<0.05；与低剂量汉黄芩素组相比，#P<0.05；与中剂量汉黄芩素组相比，&P<0.05。

图2 不同浓度汉黄芩素对RA-FLS细胞凋亡的影响Fig.2 The effect of wogonin with different concentrations on the RA-FLS apoptosis

2.4 汉黄芩素降低RA-FLS细胞MMP水平

与正常对照组细胞Rh123的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)(反应MMP大小的指标)(43.56±2.45)%相比，从低剂量到高剂量汉黄芩素处理组细胞中Rh123的MFI数值依次为(38.37±2.31)%、(32.76±2.89)%和(27.98±1.98)%，组间差异具有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

2.5 汉黄芩素增加RA-FLS细胞内ROS生成

与正常对照组细胞中DCF的MFI(5.65±0.91)%相比，从低剂量到高剂量汉黄芩素处理组细胞中DCF的MFI数值依次为(9.28±1.02)%、(12.47±1.24)%和(15.89±1.14)%，组间差异具有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

2.6 汉黄芩素通过激活p38MAPK信号通路诱导细胞凋亡

与正常对照组相比，不同剂量汉黄芩素均能够上调p-p38MAPK蛋白水平，并且呈现剂量依赖性关系，但并不影响p38MAPK总蛋白水平。与100 μg/mL汉黄芩素组相比，100 μg/mL汉黄芩素+SB203580组中细胞p-p38MAPK蛋白水平明显降低，同时细胞凋亡也明显减少，差异具有统计学意义(P<0.05)(见图3、4)。

表2 不同剂量汉黄芩素对RA-FLS细胞MMP和ROS水平的影响Table 2 The effect of wogonin with different concentrations on the levels of MMP and ROS in RA-FLS

注：与正常对照组相比，*P<0.05；与低剂量汉黄芩素组相比，#P<0.05；与中剂量汉黄芩素组相比，&P<0.05。

2.7 汉黄芩素通过介导ROS生成而激活p38MAPK信号通路

与100 μg/mL汉黄芩素组相比，100 μg/mL汉黄芩素+NAC组p-p38MAPK蛋白水平显著降低，同时细胞凋亡率也显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)(见图3、图4)。

图3 各组细胞中p38MAPK信号通路中相关蛋白检测Fig.3 The protein levels of p38 MAPK in each group detected with Western blotting注：与正常对照组相比，*P<0.05；与低剂量汉黄芩素组相比，#P<0.05；与中剂量汉黄芩素组相比，&P<0.05；与100 μg/mL汉黄芩素组相比，aP<0.05。

图4 SB203580和NAC对RA-FLS细胞凋亡的影响Fig.4 The effect of SB203580 and NAC on the apoptosis of RA-FLS

3 讨论

RA是目前临床上比较常见的一种自身免疫性疾病，病因复杂。研究表明人成纤维样滑膜细胞过度增生和分泌是RA发病的重要基础，参与关节的炎性反应和关节破坏[5]。因此，有效抑制成纤维样滑膜细胞的增殖、诱导其凋亡能够为临床治疗RA提供新的靶点和思路。汉黄芩素是从常见中药黄芩中提取的黄酮类化合物，具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤和神经保护等作用[6]。已经证实汉黄芩素能够诱导多种细胞的凋亡，例如白血病多药耐药细胞株K562/A02细胞和肝癌HepG2细胞[7-8]。本研究探讨汉黄芩素对成纤维样滑膜细胞凋亡的影响以及可能的作用机制。

本研究中首先分离纯化培养RA患者的成纤维样滑膜细胞，经过不同浓度汉黄芩素处理后，MTT实验和流式细胞术均证实汉黄芩素能够明显抑制成纤维样滑膜细胞的增殖并诱导其凋亡，并且呈现剂量依赖性关系。已知细胞凋亡的途径有多种，其中线粒体损伤介导的凋亡是最常见的凋亡，主要表现为线粒体膜电位的缺失和细胞内ROS的生成。本研究在探索汉黄芩素对RA-FLS细胞凋亡机制中发现，不同剂量汉黄芩素均能够降低细胞线粒体膜电位，同时增加细胞内ROS的生成量，并且呈现剂量依赖性关系。这表明汉黄芩素通过诱导线粒体损伤来增加细胞的凋亡。

p38MAPK蛋白是MAPKs蛋白激酶家族的主要成员之一，丝氨酸/酪氨酸残基可被磷酸化，细胞外多种应激原都可引起细胞内蛋白激酶的连锁反应，从而影响细胞的基因转录、蛋白合成和细胞表面受体表达等生物效应，在细胞凋亡中发挥着举足轻重的作用[9-10]。已有研究表明细胞内ROS生成量的增加诱导的细胞凋亡与p38MAPK信号通路密切相关[11-12]。本研究中发现不同剂量汉黄芩素能够上调p38MAPK磷酸化水平，但不影响p38MAPK总蛋白的表达。加入p38MAPK抑制剂SB203580降低细胞中p38MAPK磷酸化水平，同时能够明显逆转汉黄芩素诱导的RA-FLS细胞凋亡，这表明汉黄芩素通过激活p38MAPK信号通路诱导RA-FLS细胞的凋亡。另外，加入ROS清除剂NAC能够抑制p38MAPK的磷酸化，阻断汉黄芩素诱导的细胞凋亡。因此笔者推断ROS生成的增加能够诱导p38MAPK信号通路的激活，介导了汉黄芩素对RA-FLS细胞凋亡的诱导作用。

综上所述，汉黄芩素能够通过诱导成纤维样滑膜细胞中ROS的产生，继而激活p38MAPK信号通路而介导细胞线粒体损伤相关的凋亡。