一株桦褐孔菌伴生菌的鉴定及对肿瘤细胞的抑制作用

孙勇，蒋继宏(江苏师范大学省药用植物生物技术重点实验室，江苏徐州221116)

一株桦褐孔菌伴生菌的鉴定及对肿瘤细胞的抑制作用

孙勇，蒋继宏
(江苏师范大学省药用植物生物技术重点实验室，江苏徐州221116)

为了从药用真菌伴生菌中挖掘具有开发前景的活性菌株，通过显微形态观察结合ITs序列分析，对分离自桦褐孔菌的一株伴生菌进行鉴定，采用细胞四唑盐(MTT)法测定伴生菌和桦褐孔菌对肿瘤细胞的抑制作用。结果表明:桦褐孔菌伴生菌为顶枝孢属的一个种Acremonium sp．，并可能是一个新种;100μg/mL的伴生菌和桦褐孔菌提取物对肺癌细胞NCI-H460的抑制率为47.88%和41.32%，对胃腺癌细胞SGc-7901抑制率分别为42.64%和36.26%，对人肝癌细胞HepG2抑制效果差;而稀释10倍的伴生菌发酵液对肺癌细胞NCI-H460和胃腺癌细胞SGc-7901抑制率分别为56.81%和46.63%。

桦褐孔菌;伴生菌;ITs分析;MTT法;抗肿瘤

桦褐孔菌(Inonotus obliquus(Fr．)Pilats)，又名斜生纤孔菌，是一种生长在寒带的木腐菌，属于真菌门、担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科和纤孔菌属［1］。主要分布于北纬45°～50°之间，集中在俄罗斯的西伯利亚和远东地区、北欧的波兰和荷兰、中国的大小兴安岭和长白山地区、日本北海道以及北美北部［2］。它的菌核中含有羊毛甾醇型三萜类、桦褐孔菌醇和桦褐孔菌素、黑色素类、叶酸衍生物以及芳香物质、木质素、栓菌酸和单宁等化学成分。其中，起主要药理作用的为羊毛甾醇型三萜类、桦褐孔菌醇、桦褐孔菌素和木质素，具有抵抗肝癌、胃癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌和皮肤癌等多种肿瘤细胞，它还具有抗艾滋病病毒、抗感染、治疗糖尿病、降血压、调节血脂、抗机体衰老及增强免疫力等药理作用［3］。

大型真菌组织微环境微生物十分常见，在共生长中发挥着一定的功能。如，银耳必须有伴生菌的存在才能完成其生活史［4］;郭楚燕等［5］发现裂盖马鞍菌子实体内部存在的细菌、真菌和放线菌有可能为裂盖马鞍菌的伴生菌;纯培养的猪苓菌丝不能形成菌核，但其与伴生菌共培养，无论在实验室培养基上或用树棒栽培，猪苓菌核形成很快且发育正常;伴生菌是猪苓菌丝形成菌核的关键生物因子［6］;添加适量的伴生菌菌丝体或未灭菌的发酵液能提高猪苓菌丝的生物量，提高猪苓菌丝多糖含量［7］;点枝顶孢为四川省分布的黄褐裸盖伞、粪生裸盖伞及裸盖伞205菌株的伴生菌，与其宿主表现为偏利互生关系，并已经达到稳定的共进化平衡［8］。

在桦褐孔菌菌种的分离过程中，笔者分离到一株桦褐孔菌菌核伴生菌，能大量产生色素物质，对该菌进行常规的形态分析和ITs序列分析，对该菌进行鉴定，并采用四唑盐(MTT)法测定伴生菌发酵产物对肿瘤细胞的抑制作用，以期为以后的研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 菌株及细胞株

桦褐孔菌菌种和伴生菌均分离自东北长白山的野生桦褐孔菌菌核，保藏于江苏师范大学省药用植物生物技术重点实验室。

肿瘤细胞株:人肝癌细胞HepG2、胃腺癌细胞SGc-7901和肺癌细胞NCI-H460，均购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。

1.2 培养基

PDA培养基:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL。

PD培养基:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL。

RMPI 1640完全培养基:RMPI 1640基本培养基，10%小牛血清，10 000 U青霉素，10 000 U链霉素，Na2CO32.0 g，双蒸水1 000 mL，pH 7.0。

1.3 伴生菌形态学鉴定

1.3.1 载玻片培养法培养

在无菌操作台上将熔化后冷却至60℃以下的PDA培养基倒入培养皿，厚度为0.1～0.2 cm。接种铲在酒精灯火焰上方灼烧灭菌后，在凝固的培养基上划0.5 cm×0.5 cm的琼脂培养基小块，并将其转移至灭菌的载玻片上，将分离的桦褐孔菌伴生菌菌种活化后接种在小块四角，盖上无菌盖玻片，置于保湿培养皿中28℃进行培养2～3 d。

1.3.2 显微镜观察

将培养2 d的玻片取出，放于显微镜操作台上，用针尖轻轻拿起盖玻片的一侧，慢慢将盖玻片拿起来，挑掉周围的培养基，在新的载玻片中央滴一滴甲基蓝染液，盖玻片一侧轻放于液体边缘，轻轻盖上玻片，滤纸吸取周围的液体;调整显微镜，观察并记录分生孢子大小、形状、产孢细胞、厚垣孢子的有无等。根据Booth分类系统进行分类鉴定。

1.4 rDNA ITs区的扩增与测序

以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取伴生菌的核DNA，以真菌通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')为引物进行PCR扩增［9］，扩增程序:94℃预变性10 min，94℃预变性1 min，55℃退火性1 min，72℃延伸2 min，共25个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认后，送上海生工生物工程有限公司纯化测序。

1.5 序列数据的处理

将测得的序列在GenBank进行比对，获得美国生物信息中心(NCBI)网站提供的相似度高的真菌的相关序列，通过软件Mega 5.02构建系统进化树。

1.6 MTT法测定伴生菌与桦褐孔菌混合培养抗肿瘤活性

1.6.1 待测菌株的培养和培养获得物的处理

选用PDA培养基作为测定各菌株桦褐孔菌及其伴生菌抗肿瘤活性的培养基，将活化的菌种转接到含100 mL液体培养基的250 mL的锥形瓶中，置于培养箱中25℃恒温培养，各培养6瓶，桦褐孔菌培养20 d，伴生菌培养15 d，培养好后用真空泵抽滤真菌深层培养物，得到菌丝体和发酵液，菌丝体置于60℃电热恒温鼓风干燥箱内干燥，然后称质量，捣碎，最后放入小锥形瓶用体积分数95%的乙醇浸提7 d，抽滤取上清液，水浴蒸干后即为乙醇提取物粗品，称质量;再将其加1 mL DMSO溶解至5 mg/mL，用0.22μm微孔滤膜过滤后在4℃条件下保存;发酵液直接用0.22μm微孔滤膜过滤后放在4℃条件下保存。

1.6.2 抗肿瘤活性测定方法

1)细胞培养。用RMPI1640完全培养基在37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养人肺癌细胞NCIH460等肿瘤细胞。

2)细胞接种。将处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶从培养瓶上消化下来，1 000 r/min离心5 min，用细胞数计板计数，制成2×104个/mL的细胞悬液。96孔板中每孔加100μL RMPI1640培养基，空白对照孔加100μL不含细胞的培养基，放入细胞培养箱中过夜，使细胞贴壁。

3)加样。每孔补加RMPI1640培养基80μL，加20μL处理的发酵液或菌丝醇提物，即发酵液的最终浓度为原发酵液的0.1倍，菌丝醇提物的最终质量浓度为100μg/mL，继续培养24 h。

4)Alamar blue方法。Alamar blue贮存液用培养基以1∶1(体积比)比例稀释，每孔加50μL，每孔终体积为250μL，Alamar blue为10%，5 h后用Synergy 2多功能检测仪(BioTek公司)检测。将培养板分别放在530和590 nm的波长下，加入不含细胞的培养基的孔做空白值，加细胞液不加样品的孔做对照值，细胞培养孔减去空白值为实际值。按照公式计算细胞抑制率:细胞抑制率=(对照-样品)/对照×100%［10］。

1.7 不同溶剂对伴生菌发酵液和菌丝体活性物质的粗提效果

对桦褐孔菌伴生菌进行大量发酵，发酵产物通过抽滤获得的菌丝体和发酵液，菌丝体烘干后磨碎，用不同的有机试剂进行浸提7 d，过滤获得浸提液，使用旋转蒸发仪浓缩，干燥后测定抗肿瘤活性;发酵液使用不同溶剂萃取，萃取液浓缩后干燥称质量，再用水或DMSO配成1 mg/mL的溶液。用于测定其对胃腺癌细胞SGc-7901的抑制作用。

2 结果与讨论

2.1 伴生菌的形态

图1为桦褐孔菌伴生菌的菌落形态。由图1可知:菌落的边缘菌丝密集，不整齐呈锯齿状，呈灰白色;菌落中央为黄绿色，菌丝体平伏致密，产生水溶性墨绿色色素，培养基表面因色素存在而稍有金属光泽;老熟时，菌落中央渐变为墨绿色，有黑色油滴状分泌物。

图1桦褐孔菌伴生菌的菌落Fig.1 Colony of company fungus of Inonotus obliquus

图2 为桦褐孔菌伴生菌的显微形态。由图2可知:伴生菌孢子的分生孢子梗简单、细长，很少分枝;分生孢子无色、单胞，集聚在黏液滴中，形似粗棒形至长桶形、光滑;大小为(3.1～6.6)μm× (1.2～2.2)μm，平均长为3.8μm，宽为1.6μm。据此可将该伴生菌归为枝顶孢属(Acremonium)。

图2 桦褐孔菌伴生菌的分生孢子Fig.2 Conidiopores and conidia of company fungus of Inonotus obliquus

2.2 ITs序列及分析

ITs序列分析结果见图3。由图3可知:桦褐孔菌伴生菌与Cosmospora viridescens的亲缘关系比较近，ITs序列相似性达99%，这表明该伴生菌应属于赤壳属(Cosmospora);在枝顶孢属中发现有性型的菌种多属于赤壳属，桦褐孔菌伴生菌暂时未发现有性阶段，故暂归为枝顶孢属，其GenBank登录号为KJ777534.1。

由图3可知:该伴生菌初步鉴定为枝顶孢属的一个种(Acremonium sp．)，参照Wang等［11］对中国枝顶孢属真菌的相关特性及该属菌种的描述，没有发现完全相同的形态描述，故不能确定到具体的种，因此，推断这株菌可能为枝顶孢属的一个新种;同属的真菌作为大型真菌的伴生菌也有相关报道，点枝顶孢霉即为黄褐裸盖伞(Psilocybe fasciata)、粪生裸盖伞(P.merdaria)及裸盖伞的伴生菌。

图3 基于ITs序列构建的系统进化树Fig.3 Neighbour-joining phylogenetic tree based on internal transcribed spacer sequence analysis

2.3 桦褐孔菌及其伴生菌的发酵物对肿瘤细胞的抑制作用

表1为桦褐孔菌及其伴生菌的发酵物对肿瘤细胞的抑制作用。由表1可知:桦褐孔菌、伴生菌的发酵液和菌丝体提取物对肿瘤细胞HepG2(人肝癌细胞)的抗肿瘤活性不是很明显;对细胞HepG2(人肝癌细胞)的抗肿瘤活性按照从大到小的顺序依次为伴生菌发酵液、桦褐孔菌菌丝体提取物、伴生菌提取物和桦褐孔菌发酵液。桦褐孔菌、伴生菌对人肝癌细胞抑制率差，对肺癌细胞NCI-H460和胃腺癌细胞SGC7901有一定的抑制作用，其中，当桦褐孔菌的菌丝体提取物质量浓度为100μg/mL时，对两种肿瘤细胞的抑制率分别为47.88%和42.64%，而发酵液相对差些，稀释10倍后对两肿瘤细胞的抑制率分别为13.54%和17.27%;伴生菌的菌丝体提取物对胃癌细胞NCI-H460和胃腺癌细胞细胞SGC7901的抑制率为41.32%和36.26%，而伴生菌发酵液的抑制率反而高些，分别为56.81%和46.63%。在研究过程中，笔者发现该伴生菌的生长速度比桦褐孔菌快得多，且抗肿瘤活性优于桦褐孔菌，因此，可以认为更适合于工业发酵用于生产抗肿瘤药物。

表1 桦褐孔菌与伴生菌对肿瘤细胞的抑制作用Table 1 Inhibition of Inonotus obliquus and its companion fungus on tumor cells %

2.4 不同溶剂处理获得的伴生菌粗提物对肿瘤细胞SGc-7901的抑制作用

考察不同溶剂对伴生菌发酵液和菌丝体活性物质的粗提效果，结果见表2。

由表2可知:用丙酮提取伴生菌的菌丝体抗肿瘤活性物质的效果优于其他溶剂，当丙酮为溶剂的提取物用量为100μg/mL时，对肿瘤细胞SGc-7901的抑制率为80.95%。而发酵液中的活性成分在碱性条件下用正丁醇萃取或在酸性条件下用乙酸乙酯萃取，提取物抗肿瘤效果较好，当这2种条件下得到的提取物用量为100μg/mL时，肿瘤细胞抑制率分别为88.42%和99.49%，考虑到正丁醇沸点高于乙酸乙酯，和在水中的溶解度高于乙酸乙酯，因此，在后续的研究中将以在酸性条件下使用乙酸乙酯萃取浓缩发酵液中的活性物质来进一步研究这些活性成分的结构和功能等。

表2 不同萃取条件下的伴生菌的活性成分对肿瘤细胞SGc-7901的抑制率Table 2 Inhibition of the companion fungus extract components by different solvent on tumor cell SGc-7901

3 结论

1)通过形态观察和ITs序列测定，桦褐孔菌伴生菌初步鉴定为顶孢霉属的一个种(Acremonium sp．)。

2)伴生菌发酵液和菌丝体提取物具有与桦褐孔菌相似的抗肿瘤活性，对肿瘤细胞的抑制率稍优于桦褐孔菌。

3)对伴生菌发酵液和菌丝体提取物中抗肿瘤有效成分进行初步分离，丙酮是提取伴生菌菌丝体抗肿瘤成分的最佳试剂;则在酸性条件下(pH=4)，使用乙酸乙酯萃取发酵液抗肿瘤活性物质，其效果较好。

［1］陈艳秋，李玉．桦褐孔菌的研究进展［J］．微生物学通报，2005，32(2):124-127．

［2］钟秀宏，孙艳美，郑楷，等．桦褐孔菌多糖药理活性研究进展［J］．上海中医药杂志，2016，50(1):94-97．

［3］何坚．桦褐孔菌化学成分的研究［J］．中草药，2001，21(1): 4-6．

［4］林杰．银耳伴生菌在松杉樟木屑上的生长观察［J］．食用菌，1986(6):73-74．

［5］郭楚燕，胡建伟，李雨沁，等．裂盖马鞍菌伴生菌研究初报［J］．食用菌，2011(4):9-10．

［6］郭顺星，王秋颖，庄文颖，等．猪苓菌丝形成菌核伴生菌的发现及应用［J］．植物学报(英文版)，2002(10):1151-1154．

［7］刑晓科，郭顺星．伴生菌对猪苓菌丝生长及多糖含量的影响［J］．中国中药杂志，2008，33(13):1575-1578．

［8］何培新，张长铠．三种裸盖伞的伴生菌:点枝顶孢生物学特性研究［J］．河南科技学院学报(自然科学版)，2006，34(4):1-4．

［9］曹小迎，蒋继宏，孙勇，等．刺革菌科4种药用真菌的ITS区序列分析［J］．中草药，2007，38(2):261-264．

［10］季峰，郑维发，魏贤勇，等．桦褐孔菌石油醚提取物的抗肿瘤作用研究［J］．时珍国医国药，2007，18(6):1377-1378．

［11］WANG Y Z，GUO F，ZHOU Y G．Survey of Acremonium species from China with three new records［J］．Mycosystema，2002，21 (2):192-195．

(责任编辑荀志金)

Identification of a strain of companion fungus of Inonotus obliquus and its activity againsttumor cell

SUN Yong，JIANG Jihong
(Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plant of Jiangsu Province，Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116，China)

In order to screen active strains from medicinal fungi，we used microscopic morphology and internal transcribed spacer(ITs)sequence analysis to classify the companion fungus separated from Inonotus obliquus，and studied the inhibition of the companion fungus and Inonotus obliquus fermentation on tumor cells by the 3-［4，5-dimethylthiazol-2-yl］-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT)colorimetric assay．The companion fungus is Acremonium sp．，and may be a new species．The extract of the companion fungus and Inonotus obliquus could inhibited 47.88%and 41.32%NC2-H460 cells，42.64%and 36.26% gastric adenocarcinoma cells SGC-7901，respectively．However，the extract of the companion fungus and Inonotus obliquus inhibited hardly human hepatoma cell HepG2．When the broth of the companion fungus was 10 times diluted，it inhibited 56.81%NCI-H460 cells and 46.63%SGc-7901 cells．

Inonotus obliquus;companion fungus;ITs sequence analysis;MTT method;antitumor

Q939.9

A

1672－3678(2017)04－0082－05

10.3969/j.issn.1672－3678.2017.04.014

2017－02－28

江苏师范大学省药用植物生物技术重点实验室开放课题(KLBMP1305)

孙勇(1977—)，男，江西高安人，讲师，研究方向:微生物学;蒋继宏(联系人)，教授，E-mail:jhjiang@jsnu．edu．cn