LC-MS/MS方法测定比格犬血浆中沙芬酰胺及其代谢物

杨可为，郝元斌，邹巧根(南京工业大学药学院，江苏南京211800)

LC-MS/MS方法测定比格犬血浆中沙芬酰胺及其代谢物

杨可为，郝元斌，邹巧根
(南京工业大学药学院，江苏南京211800)

建立液相色谱-质谱联用/质谱(LC-MS/MS)测定比格犬血浆中沙芬酰胺异构体及其代谢物浓度的方法，在此基础上对沙芬酰胺异构体及其代谢物在比格犬体内的药代动力学进行研究。色谱检测条件方法一为用AS-RH手性柱测定沙芬酰胺异构体;方法二为用XB-C18分析柱测定沙芬酰胺代谢物。质谱条件离子源为APCI源，离子化方式为正离子模式，喷雾电压5 200 V，加热毛细管温度550℃，雾化气(N2)流速75.8 KPa，气帘气(N2)75.8 KPa，碰撞气(N2)55.16 KPa，扫描方式为多反应监测(MRM)。建立的LC-MS/MS方法线性范围左旋沙芬酰胺为10～2 000 ng/mL(r=0.999 4)，右旋沙芬酰胺为10～2 000 ng/mL(r=0.997 6)，沙芬酰胺代谢物为10～1 000 ng/mL (r=0.994 1)。本方法灵敏，快速且稳定，适用于沙芬酰胺异构体及其代谢物药代动力学研究。

沙芬酰胺;代谢物;药代动力学;LC-MS/MS

甲磺酸沙芬酰胺的化学名称为(+)-(S)-2-［［对-［(间-氟苄基)氧基］苄基］氨基］丙酰胺-甲磺酸盐，该药物为手性药物，并具有单一手性中心。沙芬酰胺是可逆的选择性单胺氧化酶B(MAO-B)抑制剂，与谷氨酸盐的释放相互作用，能够减少在帕金森综合征进程中相关基底核中纹状体多巴胺传递和谷氨酸通道的过度活跃性，因此可以作为抗帕金森药物［1－2］。沙芬酰胺的主要代谢物是沙芬酰胺酸［3］。关于手性药物，对映异构体具有几乎相同的物理性质(旋光性除外)和化学性质(在手性环境中除外)，但生物系统常常很容易区分它们，并可能导致不同的药代动力学性质(吸收、分布、代谢和排泄)以及药理学、毒理学效应的量或质的区别。代谢产物在血浆中长期积累将产生有毒物质并损害健康［4］，Leuratti等［3］采用的液相色谱-质谱联用/质谱(LC-MS/MS)方法检测了沙芬酰胺代谢物，缺点是检测时间非常长(50 min)。Dal等［5］采用的方法检测了沙芬酰胺，但没有检测沙芬酰胺代谢物。Marzo等［6］采用的方法检测了沙芬酰胺没有检测沙芬酰胺异构体。Kumar等［7］采用的方法检测了沙芬酰胺异构体，定量下限很高(50 ng/mL)，不够灵敏。

液相色谱-质谱联用技术在分析药物及其在各种复杂生物基质(全血、血浆、尿、胆汁及生物组织)中的代谢产物时，由于其选择性强、灵敏度高，不仅可以避免复杂、繁琐、耗时的样品前处理工作，而且能分离鉴定以往难以辨识的痕量药物代谢产物，尤其是串联质谱(MS/MS)的应用，通过多反应监测(MRM)，可以大大提高分析的专一性，改善信噪比，提高灵敏度，从而快速、方便地解决问题［8－9］。比如Cao等［10］采用LC-MS/MS方法检测了雷贝拉唑对映异构体及其代谢物。

在本研究中，笔者拟用LC-MS/MS方法来检测沙芬酰胺异构体及代谢物，以期为研究沙芬酰胺及其代谢产物提供实际数据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

甲磺酸沙芬酰胺片剂、沙芬酰胺异构体、沙芬酰胺酸，笔者所在实验室自制。右旋雷贝拉唑(纯度大于99%)、咪唑乙醇(纯度大于99%)，南京海纳医药科技有限公司。NH4HCO3(HPLC级)，阿拉丁公司。甲醇、乙腈(HPLC级)，默克公司。纯水，默克公司纯水仪制取。其他化学试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器

安捷伦1100型液相色谱仪(LC-MS/MS)，Agilent Technologies，配备有电喷雾电离(APCI)接口使用正离子模式的API 3000三重四级杆质谱仪(AB Sciex)组成。色谱数据和采集使用的是软件Analyst version 1.5.2(AB Sciex)。

1.3 色谱条件

测定沙芬酰胺异构体的色谱条件。AS-RH手性柱(4.6 mm×150 mm，5μm，中国大赛璐公司);流动相A为5 mmol/L NH4HCO3水溶液、B为乙腈，梯度洗脱(0～16 min，20%B;16～18 min，20%～70% B;18～29 min，70%B;29～31 min，70%～20%B; 31～36 min，20%B);流速为0.4 mL/min;柱温为25℃;进样量为5.0μL。

测定沙芬酰胺代谢物的色谱条件。XB-C18分析柱(4.6 mm×50 mm，3μm，中国月旭科技公司);流动相A为水(含0.1%甲酸)、B为乙腈(含0.1%甲酸)，梯度洗脱(0～0.5 min，20%B;0.5～1.5 min，20%～90%B;1.5～4 min，90%B;4～5 min，90%～20%B;5～5.5 min，20%B);流速为1 mL/ min;柱温为40℃;进样量为10.0μL。

1.4 质谱条件

离子源为APCI源(离子化方式为正离子模式);喷雾电压为5 200 V;加热毛细管温度为550℃;雾化气(N2)流速75.8 kPa，气帘气(N2)75.8 kPa，碰撞气(N2)55.16 kPa;扫描方式为多反应监测(MRM)。

用于检测的各待测物的离子反应分别是:m/z 302.4→m/z 215.3(沙芬酰胺)、m/z 303.6→m/z 215.2(沙芬酰胺酸)、m/z 360.2→m/z 242.0(右旋雷贝拉唑)、m/z 257.2→m/z 125.0(咪唑乙醇)。图1为沙芬酰胺及沙芬酰胺酸的标准质谱图。

1.5 血浆样品预处理

沙芬酰胺异构体样品制备。血浆样品取采用液液萃取，取100μL血浆注入聚乙烯管随后加入50μL内标右旋雷贝拉唑(1μg/mL)，涡旋3 min。然后加入400μL乙酸乙酯涡旋3 min，将混合物以12 000 r/min离心10 min。取300μL上清液40℃氮吹。然后加入5 mmol/L NH4HCO3-乙腈(体积比80∶20)溶液100μL复溶，涡旋3 min，以12 000 r/min离心10 min。转移至进样品，使用LC-MS/MS系统进行分析。

沙芬酰胺代谢物样品制备。血浆样品萃取采用液液萃取，取100μL血浆样品注入聚乙烯管，随后加入50μL内标咪唑乙醇(1μg/mL)，涡旋3 min。然后加入400μL乙酸乙酯涡旋3 min，将混合物以12 000 r/min离心10 min。取300μL上清液40℃氮吹。然后加入水(含0.1%甲酸)-乙腈(含0.1%甲酸)(体积比为80∶20)溶液100μL复溶，涡旋3 min，以12 000 r/min离心10 min。转移至进样品，使用LC-MS/MS系统进行分析。

1.6 储备液、校准标准血浆样品和质量控制样品的制备

左旋沙芬酰胺、右旋沙芬酰胺、沙芬酰胺酸、右旋雷贝拉唑和咪唑乙醇的储备液用甲醇配制。一系列工作标准溶液的制备通过用甲醇稀释储备液到对应系列质量浓度:左旋沙芬酰胺和右旋沙芬酰胺分别为20、15、10、5、1、0.5、0.2和0.1μg/mL;沙芬酰胺酸为10、5、1、0.5、0.2和0.1μg/mL;右旋雷贝拉唑为1μg/mL;咪唑乙醇为1μg/mL。所有工作溶液保持在-20℃。

校正标准血浆样品。每10μL工作标准溶液用90μL空白比格犬血浆混合得到浓度为10、20、50、100、500、1 000、1 500和2 000 ng/mL的左旋沙芬酰胺或右旋沙芬酰胺;10、20、50、100、500和1 000 ng/mL的沙芬酰胺酸。

质量控制样品的制备。左旋沙芬酰胺和右旋沙芬酰胺浓度为20、800和1 600 ng/mL;沙芬酰胺酸浓度为20、400和800 ng/mL。

图1 沙芬酰胺(a)及沙芬酰胺酸(b)的化学结构和离子质谱图Fig.1 Chemical structures and product ion mass spectra of safinamide(a)and safinamide acid(b)

1.7 药代动力学的研究

成年比格犬12只(6公、6母)，随机分为2组，每组6只，雌雄各半，分3周期完成试验。比格犬片剂口服给药，使用真空采血管于给药前(0 min)及口服给药结束后(15±1)、(30±1)、(45±1)、(60±1)、(90±1)、(120±1)、(180±1)、(240±1)、(300±1)、(360±1)、(420± 1)、(480±1)、(600±1)、(660±1)、(1 440±1)和(2 100± 1)min静脉采血约2 mL，抗凝剂为EDTA-K2，全血在4℃条件下以5 000 r/min离心10 min，获得血浆样品，预处理后使用LC-MS/MS系统进行分析。

2 结果与讨论

2.1 专属性

图2显示了血浆样品加入一定浓度的左旋沙芬酰胺、右旋沙芬酰胺和右旋雷贝拉唑(内标)及沙芬酰胺酸和咪唑乙醇(内标)标准溶液和比格犬口服50 mg甲磺酸沙芬酰胺15 min后分别用AS-RH手性柱和XB-C18分析柱测得的MRM质谱图。由图2可知:左旋沙芬酰胺、右旋沙芬酰胺、沙芬酰胺酸和内标互不干扰，峰形良好，无杂峰干扰，基线平稳。

图2 血浆样品加入一定浓度的标准溶液和比格犬口服50 mg甲磺酸沙芬酰胺15 min后的MRM质谱图Fig.2 A plasma sample added with standard solution of a certain concentration and dog plasma samples obtained at 15 min after oral adminostration of 50 mg safinamide metharesulforate

2.2 线性及定量下限

根据标准曲线，所有待测物在浓度范围内呈线性，典型标准曲线分别见图3～5。由图3～5可知:左旋沙芬酰胺的线性方程为Y=0.000 361X+0.007 9 (r=0.999 4，n=6)，10～2 000 ng/mL;右旋沙芬酰胺的线性方程为Y=0.000 3X+0.000 48(r=0.997 6，n= 6)，10～2 000 ng/mL;沙芬酰胺酸的线性方程为Y= 0.003 76 X+0.012 4(r=0.994 1，n=6)，10～1 000 ng/mL。左旋沙芬酰胺和右旋沙芬酰胺定量下限为10 ng/mL，沙芬酰胺酸定量下限为10 ng/mL。

2.3 精密度及准确度测定

取空白血浆，按上述血浆样品处理方法制备所有分析物的质控样品、左旋沙芬酰胺、右旋沙芬酰胺及沙芬酰胺酸的批内、批间精密度(RSD)均小于15%，结果见表1，由表1可知，实验结果符合生物样品的测定要求。

图3 LC-MS/MS法测定血浆中左旋沙芬酰胺标准曲线(方法验证第2天)Fig.3 The standard curve of(S)-safinamide in beagle plasma by LC-MS/MS method(Run.2)

2.4 提取回收率与基质效应

取空白血浆，按上述血浆样品处理方法制备所有分析物的质控样品，以血浆中分析物的峰面积与相应浓度的标准溶液中分析物峰面积的比值计算出上述质控样品浓度的提取回收率。左旋沙芬酰胺、右旋沙芬酰胺及沙芬酰胺酸的提取回收率见表2。由表2可知，在实验中未观察到明显的基质效应。

图4 LC-MS/MS法测定血浆中右旋沙芬酰胺标准曲线(方法验证第2天)Fig.4 The standard curve of(R)-safinamide in beagle plasma by LC-MS/MS method(Run.2)

图5 LC-MS/MS法测定血浆中沙芬酰胺酸标准曲线(方法验证第2天)Fig.5 The standard curve of safinamide acid in beagle plasma by LC-MS/MS method(Run.2)

表2 沙芬酰胺对映体及沙芬酰胺酸的提取回收率与基质效应Table 2 Extraction recovery and matrix effect ofsafinamide enantiomers and metabolite

2.5 稳定性

考察沙芬酰胺对映体及代谢物在以下存放及处理条件下的稳定性:低、中和高浓度质控血浆样品室温4 h的短期稳定性;－80℃下20 d的长期稳定性;反复冻融的稳定性;质控样品按上述血浆样品处理方法提取后4℃下储存在自动进样器里48 h的稳定性，结果见表3。由表3可知:沙芬酰胺对映体及代谢物在所有条件下稳定性良好。

2.6 药代动力学研究结果

两个LC-MS/MS方法成功地用于比格犬口服甲磺酸沙芬酰胺(50 mg)后比格犬体内沙芬酰胺及沙芬酰胺酸的药代动力学研究［9］。由图6可知，比格犬口服甲磺酸沙芬酰胺后沙芬酰胺及沙芬酰胺酸的平均血药浓度-时间曲线见图6。在比格犬体内没有检测到右旋沙芬酰胺，这表明沙芬酰胺在体内没有手性转化。将数据用DAS 2.0软件进行统计矩分析，求算出沙芬酰胺及沙芬酰胺酸在比格犬体内的药代动力学参数，结果见表4。由表4可知:左旋沙芬酰胺在比格犬体内没有发生手性转化，左旋沙芬酰胺在口服后1.5 h左右达到峰浓度，沙芬酰胺酸在口服2 h左右达到峰浓度。(左旋沙芬酰胺的半衰期为5.09 h左右，沙芬酰胺的半衰期为4.59 h左右。)

表1 沙芬酰胺对映体及沙芬酰胺酸的批间批内精密度Table 1 Intra-and inter-day precision and accuracy for safinamide enantiomers and metabolite

表3 沙芬酰胺对映体与代谢物的稳定性研究Table 3 Stability analysis of safinamide enantiomers and metabolite under various conditions(n=6)

图6 比格犬口服50 mg甲磺酸沙芬酰胺后左旋沙芬酰胺及沙芬酰胺酸的血药质量浓度-时间曲线Fig.6 Plasma concentration-time profiles of(S)-safinamide and safinamide acid after oral administration of 50 mg safinamide methanesulfonate to beagle dogs

表4 比格犬口服沙芬酰胺后左旋沙芬酰胺和沙芬酰胺酸的平均药代动力学参数Table 4 Mean pharmacokinetic parameters for(S)-safinamide and safinamide acid after oral administration to beagle dogs

3 结论

本文建立了LC-MS/MS方法用于测定比格犬血浆中沙芬酰胺异构体及沙芬酰胺酸。以AS-RH手性柱为基础测定了沙芬酰胺异构体，以XB-C18分析柱测定了沙芬酰胺酸。此法灵敏度高、专属性好、线性良好、精密度良好且准确度高，在方法学研究的基础上，可成功应用于药代动力学研究。结果显示，沙芬酰胺在体内没有手性转化。这些实验结果为进一步研究沙芬酰胺及其代谢物提供了实验数据和理论基础。

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(责任编辑周晓薇)

Determination of safinamide and its metabolites in beagle dog plasma by LC-MS/MS

YANG Kewei，HAO Yuanbin，ZOU Qiaogen
(College of Pharmacy，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China)

An LC-MS/MS method was developed to determine safinamide enantiomers and their metabolite in beagle dog plasma to study the pharmacokinetic．The first method to determine safinamide enantiomers was using AS-RH chiral column．The second method todetermine safinamide metabolites was using an XB-C18 column．The mass spectrometric conditions were:APCI as ion source for ionization in positive ion mode，spray voltage 5 200 V，capillary temperature 550℃，atomization gas flow rate 75.8 KPa (N2)，curtion Gas(N2)75.8 KPa，collision Gas 55.16 KPa，andthe scanning mode for multiple reaction monitoring(MRM)．LC-MS/MS method was establishedfor the linear range of(S)-safinamide 10～2 000 ng/mL(r=0.999 4)，(R)-safinamide metabolite for 10～2 000 ng/mL(r=0.997 6)，safinamide acid 10～1 000 ng/mL(r=0.994 1)．This method was sensitive，rapid，stable and suitable for the pharmacokinetic study of safinamide enantiomers and theirmetabolites．

safinamide;metabolite;pharmacokinetic;LC-MS/MS

R969.1

A

1672－3678(2017)04－0070－07

10.3969/j.issn.1672－3678.2017.04.012

2016－12－04

杨可为(1992—)，男，江苏南京人，研究方向:药剂学;邹巧根(联系人)，教授，E-mail:zouqiaogen@healthnice．net