液质联用检测果蔬中阿维菌素、甲维盐的残留

朱丽清，陈泳，冷波，潘裕添(.闽南师范大学菌物产业工程技术中心，福建漳州363000;.漳州出入境检验检疫局，福建漳州363000)

液质联用检测果蔬中阿维菌素、甲维盐的残留

朱丽清1，陈泳2，冷波1，潘裕添1
(1.闽南师范大学菌物产业工程技术中心，福建漳州363000;2.漳州出入境检验检疫局，福建漳州363000)

建立利用分散固相萃取-高效液相色谱串联质谱法(QuEChERS-LC/MS/MS)同时测定蔬菜和水果中阿维菌素和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(甲维盐)残留的方法。均质样品经过醋酸乙腈提取，由N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂分散固相萃取净化后，利用液相色谱-串联质谱分离测定，并对质谱条件进行优化。结果表明:碰撞气34 475 Pa、气帘气103 425 Pa、雾化气344 750 Pa、辅助加热气172 375 Pa、离子喷雾电压5 500 V以及去溶剂温度300℃时，检测灵敏度最高。对3种蔬菜和水果样品中添加阿维菌素和甲维盐，进行2个水平的加标回收试验，每个水平重复6次，3种样品的平均回收率范围为81.3%～112.9%，相对标准偏差为1.802%～11.506%，达到技术标准要求。该方法被证实是稳定、高效的，可适用于多种蔬菜水果中阿维菌素和甲维盐的测定。

分散固相萃取-高效液相色谱串联质谱;阿维菌素;甲维盐;农产品检测

阿维菌素是一类具有杀虫、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物，而甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(甲维盐)是以阿维菌素为原料经过结构修饰而得到的一种高效生物杀虫剂［1］。因为它独特的致毒机理，使甲维盐成为高效、广谱的新型抗生素类的杀虫剂，同时，由于甲维盐对线虫与节肢动物驱杀效果显著，已被广泛应用于果蔬虫害的防治［2－4］，属于一种高效低毒生物杀虫剂［5］。欧盟规定最大残留限量值为0.01 mg/kg，我国规定最大残留限量值为0.02～0.05 mg/kg［6］。

分散固相萃取(QuEChERS)技术是由美国学者于2002年提出的农药残留快速提取的方法［7］。它能提供高质量的农药残留分析，是一种快速、简洁、低成本的前处理方法，最近几年来发展迅速。经多方研究学者反复多次实验证实QuEChERS法可检测200多种农药，其中包括含有脂肪的介质体系［8－10］。QuEchERS法的主要步骤是:样品在传统萃取液乙腈中添加1%醋酸后进行浸提，混匀后加入无水MgSO4和醋酸钠，充分振荡促使其分层，再将浸提液移到吸附剂(PSA)、MgSO4的离心管后进行离心，将离心上清液通过GC/MS(气质联用)或LC/MS进行测定。

本文中采用分散固相萃取-高效液相色谱串联质谱法，以创建可以同时测定果蔬中阿维菌素和甲维盐的方法，以期能适用于果蔬中阿维菌素和甲维盐的检测。

1 材料与方法

1.1 仪器、材料与试剂

API 4000四极杆串联质谱仪，美国AB公司; 1200 Series液相色谱仪，美国Agilent公司;T25型高速分散机，德国IKA公司;3-30K型高速冷冻离心机，Sigma公司;QT-2型旋涡混合器，上海琪特分析仪器有限公司;MilliQ高纯水发生器，美国Millipore公司;XP204型分析天平(可读性0.1 mg)，瑞士Mettler公司。

毛豆、白花菜和蜜柚3种待测样品，市售。阿维菌素和甲维盐标准品(纯度均为99%)，Sigma-Aldrich公司;甲酸(色谱纯)，美国Fluka公司;无水MgSO4、无水醋酸钠(优质纯)，美国Waters公司;乙腈(色谱纯)，德国Merck公司;乙二胺N-丙基硅烷吸附剂(PSA，粒径40μm)，美国Waters公司;实验用水均为高纯水。

1.2 试剂配制

1.2.1 单一标准工作液的配制

分别精密称取阿维菌素0.020 1 g、甲维盐0.020 8 g标准品于不同的50 mL容量瓶中，用乙腈定容，避光保存，待用。该溶液可在0～4℃存放6个月，质量浓度分别为402和416μg/mL。

1.2.2 混合标准工作液的配制

分别准确移取上述的2个单标储备液124、120 μL于50 mL的容量瓶，采用乙腈定容，稀释成1 μg/mL的混合标准工作液，用于添加回收实验和制备标准溶液系列，4℃条件下避光保存。

1.2.3 基质匹配溶液的配制

基质匹配溶液的配制情况见表1。

表1 基质匹配溶液配制Table 1 Matrix matching solution preparation

1.3 方法

1.3.1 制样

分别取毛豆、白花菜和蜜柚3种待测样品500 g，使用组织捣碎机捣碎均匀，放入洁净的盛样袋内，密封后标明标记。将待测样于－4℃条件下冰箱冷冻保藏。

1.3.2 提取及净化

准确称取10.00 g搅碎后的待测样品，精确至0.01 g，放入50 mL离心管中，加19.8 mL乙腈，0.2 mL醋酸，再加入1.5 g无水醋酸钠和6 g无水MgSO4，用均质器以15 000 r/min高速均质1 min后，以3 000 r/min离心5 min。取6 mL上层乙腈提取液于装有900 mg无水MgSO4和150 mg PSA的离心管中，旋涡混合1 min后，以3 000 r/min离心5 min，取0.75 mL上清液与水1∶1体积比混合均匀。经0.2μm微孔滤膜过滤，待测［11］。

1.3.3 优化质谱参数

对气帘气(CUR)、雾化气(GS1)、辅助加热气(GS2)、离子喷雾电压(IS)、去溶剂温度(TEM)和调节碰撞气(CAD)6个参数分别进行优化，即改变其中1个参数时，其他5个参数不变，最终选择信号最佳时的参数值为该参数的优化值。

1.4 仪器条件

1.4.1 HPLC条件

色谱柱CORTECS C18(100 mm×2.1 mm，2.7 μm)，柱温为35℃，进样量为10μL。

表2 梯度洗脱流动相及流速Table 2 Gradient elution mobile phase and flow rate

1.4.2 MS/MS条件

电喷雾离子源(ESI)，离子喷雾电压5 500 V;气帘气流速15 mL/min;雾化器流速50 mL/min;碰撞气(N2)流速5 mL/min;辅助加热气流速25 mL/min;去溶剂温度300℃;正离子模式;动态多反应监测(Dynamic MRM)方法采集，质谱采集速率100 ms/转，其他参数见表3。

表3 阿维菌素和甲维盐的母离子、子离子及碰撞能量和去簇电压Table 3 Avermectin and emamectin's mother ion，subion，impact energy and cluster voltage

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

ESI离子源为软电离方式，阿维菌素和甲维盐在ESI离子源内与H+、NH4+等结合形成准分子离子峰。因为甲氨基阿维菌素在自然界不稳定，经过化学修饰后是以甲维盐的形式相对稳定存在，甲维盐分子量为1 008.24［12］。本实验对标准品甲维盐进行了母离子扫描(MS scan)获得了一级质谱图，在扫描图里没有发现［M+H］(m/z为1 009.2)的离子峰，这是由于甲维盐在水介质中已经完全解离成甲氨基阿维菌素(C19H75NO13，分子量为886.4)与苯甲酸盐(C7H6O2，分子量为122)，因此本实验是以甲氨基阿维菌素为检测目标。甲氨基阿维菌素是以准分子离子峰［M-C7H5O2+H］(m/z为886.4)的形式存在。实验对阿维菌素也进行了母离子扫描(MS scan)获得一级质谱图，得知阿维菌素的准分子离子峰为［M+NH4+］(m/z为890.6)。

离子源去溶剂气体温度、离子喷雾电压等因素对阿维菌素和甲维盐的离子加合物形态有较大的影响，为此本实验通过优化了去溶剂气温度、离子喷雾电压等参数，为使母离子强度达到最高，结果见图1。

由图1(a)可知，当碰撞气(CAD)选择34 475 Pa时，阿维菌素和甲维盐的检出信号最高。由图1 (b)可知，当气帘气(CUR)选择103 425 Pa时，阿维菌素和甲维盐的检出信号最高。由图1(c)可知，当雾化气(GS1)选择344 750 Pa时，阿维菌素和甲维盐的检出信号最强。由图1(d)可知，对于甲维盐，当离子喷雾电压(IS)为4 500 V时，其信号值最高，但是阿维菌素的信号值却是在IS为5 500 V时最高。由于甲维盐在IS为5 500 V时的信号值与4 500 V时的信号值相差不大，而阿维菌素却有显著差异，综合考虑，实验最终选择了IS为5 500 V。由图1(e)可知，当去溶剂温度(TEM)为200℃时，阿维菌素的信号值最高，但甲维盐的信号值却最低，综合考虑到两种物质的检出信号，实验最终选择TEM为300℃，虽然这个时候两种物质信号值均不是最高，但是跟最大值的差距不大。由图1(f)可知，当辅助加热气(GS2)选择172 375 Pa时，阿维菌素和甲维盐的检出信号最高。由图1可得最优参数组合为CAD为34 475 Pa，CUR为103 425 Pa，GS1为344 750 Pa，IS为5 500 V，TEM为300℃，GS2为172 375 Pa。

2.2 线性范围与检出限

对空白毛豆、白花菜和蜜柚进行基质配标，制得不同浓度的5种阿维菌素混合标准溶液，按本实验方法进行测定，以3倍空白基质信噪比计算出方法的检出限，以10倍信噪比计算方法定量下限。阿维菌素检出限为0.4μg/kg，甲维盐的检出限为0.9 μg/kg。分别以各化合物定量离子的峰面积对浓度绘制标准曲线，得到阿维菌素和甲维盐的回归方程、线性范围及相关系数(r)，见表4。由表4可知，在各自的定量下限至200μg/L时，目标物的峰面积(Y)与其质量浓度的线性关系良好，r均达到0.998 7以上。2.3本方法的平均回收率与精密度

图1 碰撞气(CAD)，气帘气(CUR)，雾化气(GS1)，去溶剂温度(TEM)，离子喷雾电压(IS)和辅助加热气(GS2)对阿维菌素和甲维盐检出信号的影响Fig.1 Effects of CAD，CUR，GS1，TEM，IS and GS2 for avermectin and emamectin detection signal

表4 阿维菌素和甲维盐的线性方程、相关系数(r)、检出限和定量下限Table 4 Avermectin and emamectin's linear equation，correlation coefficient(r)，idetection limit and quantification offline

以毛豆、白花菜和蜜柚3种果蔬作为空白基质进行了2个水平的加标回收实验(n=6)，它们的添加水平均为10、20μg/kg，平均回收率和精密度结果见表5。由表5可知，阿维菌素和甲维盐的平均回收率为81.3%～112.9%，相对标准偏差(RSD)为 1.802%～11.506%。

图2为2种化合物在白花菜中10μg/kg添加水平的提取离子色谱图。由图2可以看出，空白样品的背景并未干扰到目标分析物的测定，并不影响实际样品中阿维菌素和甲维盐的定性和定量分析。

表5 阿维菌素和甲维盐在水果、蔬菜中的平均回收率和相对标准偏差(n=6)Table 5 Avermectin and emamectin in fruits，vegetables，standard addition recoveries and relative standard deviation(n=6)

图2 甲维盐的白花菜基质匹配标准溶液(10μg/kg)的提取离子色谱Fig.2 Extracted ion chromatogram of a matrix-matched standard solution at 10μg/kg prepared in cleome for emamectin and avermectin

3 结论

采用乙腈高速匀浆提取样品，PSA吸附剂净化，于加热电喷雾离子源正离子模式采集、三重四级杆质谱仪选择性反应监测下，对果蔬中阿维菌素和甲维盐药物残留进行测定。对质谱条件进行优化，结果表明，碰撞气34 475 Pa、气帘气103 425 Pa、雾化气344 750 Pa、辅助加热气172 375 Pa、离子喷雾电压5 500 V、去溶剂温度300℃时检测灵敏度最高。在对3种蔬菜和水果样品中添加阿维菌素和甲维盐，进行2个水平的加标回收试验，每个水平重复6次，3种样品的平均回收率范围达到81.3%～112.9%，相对标准偏差为1.802%～11.506%。该方法前处理简便，灵敏度、准确度和精密度均高，各种指标符合残留监测的相关要求，可用于果蔬中阿维菌素和甲维盐的检测。

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(责任编辑周晓薇)

Determination of avermectin and emamectin residues in vegetables and fruits by QuEChERS-LC/MS/MS

ZHU Liqing1，CHEN Yong2，LENG Bo1，PAN Yutian1
(1．The Engineering Technological Center of Mushroom Industry，Minnan Normal University，Zhangzhou 363000，China; 2．Zhangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhangzhou 363000，China)

We developed a method to determine avermectin and emamectin residues in vegetables and fruits by QuEChERS-LC/MS/MS．Samples were extracted by acetonitril with 1%acetate，followed by purifying with dispersive solid phase extraction using PSA．Avermectin and emamectin in samples were determined by LC/MS/MS．The conditions of mass spectrometry was optimized as following:CAD at 34 475 Pa，CUR at103 425 Pa，GS1(nebulizer gas)at344 750 Pa，GS2(heater gas)at172 375 Pa，IS (ion spray voltage)at5 500 V，and TEM at300℃．Avermectin and emamectin in two levels were spiked into 3 vegetables or fruits and determined(6 replicates of each level)．The average recovery ranged from 81.3%to 112.9%，the precisions(RSD)from 1.802%to 11.506%，meeting the requirements of technical standards．This method was proved to be robust，efficientand competent to determine avermectin and emamectin residues in fruits and vegetables．

QuEChERS-LC/MS/MS;avermectin;emamectin;detection of agricultural products

TS255.7

A

1672－3678(2017)04－0028－06

10.3969/j.issn.1672－3678.2017.04.005

2016－10－20

朱丽清(1991—)，女，福建龙岩人，研究方向:化学生物学;潘裕添(联系人)，教授，E-mail:xmpyt@sina．com