来氟米特对前列腺癌PC3细胞增殖与凋亡的影响*

周 华， 姜科声， 黄巧丽， 陈艺成， 李彦明， 李 涛

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004;2.浙江大学 医学院附属邵逸夫医院，浙江 杭州 310031；3.河南大学 附属淮河医院，河南 开封 475000)



来氟米特对前列腺癌PC3细胞增殖与凋亡的影响*

周 华1， 姜科声1， 黄巧丽1， 陈艺成2， 李彦明3， 李 涛1

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004;2.浙江大学 医学院附属邵逸夫医院，浙江 杭州 310031；3.河南大学 附属淮河医院，河南 开封 475000)

为了研究来氟米特(LEF)对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响，采用前列腺癌细胞株PC3与不同浓度的来氟米特(0,50,100,150 μmol5L-1)共培养(24,48,72 h)，通过CCK-8细胞活力检测实验和克隆形成实验，发现来氟米特抑制PC3细胞增殖，且存在明显的浓度时间依赖性；流式细胞检测表明,来氟米特使PC3细胞发生S期阻滞，并且促进其凋亡；当来氟米特浓度≥150 μmol5L-1时，Western Blot实验检测到Caspase-3蛋白发生剪切活化.来氟米特处理可诱导PC3细胞自噬，采用羟氯喹抑制自噬可促进细胞凋亡的发生，提示自噬增强了细胞抗凋亡能力.研究表明，来氟米特可抑制PC3细胞的增殖，诱导其凋亡，可能对前列腺癌有潜在的治疗作用.

来氟米特；前列腺癌；增殖；凋亡；自噬

老药新用是药物研发的有效途径之一，同时老药亦可作为先导药物，通过充分揭示其结构-药效关系，进一步衍生、开发新型药物.来氟米特(Leflunomide,LEF)是一种人工合成的小分子异噁唑类化合物，具有抗增殖及免疫抑制作用，在临床上用于治疗风湿性关节炎及防治移植物抗宿主反应.基于LEF是已获批准上市的药物，临床应用中尚未发现严重毒副反应，因此,发掘其潜在的药理效应、拓展其应用范围具有重要的实际价值.

来氟米特在细胞内代谢为丙二酸次氮酰胺(A771726)，从而发挥药效.A771726能可逆地抑制二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)的活性.DHODH是嘧啶从头合成过程中的关键限速酶，A771726对DHODH的抑制导致细胞嘧啶合成障碍，从而限制了细胞增殖.来氟米特及其代谢产物A771726在低浓度时主要通过对DHODH的抑制发挥增殖拮抗作用，此作用可以被外源添加的嘧啶所逆转，导致细胞增殖能力的恢复[1-2].

近来发现，来氟米特可通过旁路途径影响细胞增殖，在较高浓度时其增殖抑制作用不受外源嘧啶的干扰.已发现来氟米特和A771726可以抑制 NF-κB的激活，下调NF-κB 调控的TNF，IL-1和VEGF等炎性及增殖基因的表达[3].来氟米特及A771726在高浓度时可以抑制许多受体蛋白的表达或干扰受体酪氨酸激酶的活性，这一类受体包括多个生长因子的受体如EGF,TGF及PDGF受体，它们在肿瘤中多呈现高丰度表达，与肿瘤的快速扩增、侵袭及预后有关.来氟米特抑制这些受体所具有的蛋白酪氨酸激酶活性，干扰细胞增殖刺激信号的转导，在肿瘤治疗方面具有重要的应用价值[1,4-6].目前，已发现来氟米特对乳腺癌、神经母细胞瘤、骨髓瘤、淋巴瘤等恶性肿瘤都具有明显的抑制效果,但对前列腺癌等肿瘤的作用还缺少细致的研究.本研究以PC3细胞为研究对象，在体外研究了来氟米特对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响.

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

人前列腺癌细胞株PC3购于中国科学院上海细胞生物研究所.来氟米特和羟氯喹(HCQ)购自Sigma公司.Cell Counting Kit-8(CCK-8)，Annexin V/PI apoptosis kit凋亡检测试剂盒和Cell cycle kit周期检测试剂盒均购于杭州联科生物技术有限公司；结晶紫染色液、Western Blot试剂盒、抗β-actin抗体、苯甲基磺酰氟(PMSF)、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)、Protein Ladder和PVDF膜均购于碧云天.细胞培养皿、Eppendorf管、15 mL或50 mL离心管、96孔或6孔培养板均购自美国Corning.0.25% Trypsin & 0.02% EDTA胰酶，RPML1640培养基和磷酸盐缓冲液(PBS)均购自吉诺生物医药技术有限公司.四季青胎牛血清购自浙江天杭生物技术有限公司；RIPA中性裂解液购于上海威奥生物技术有限公司；BCA蛋白定量分析试剂盒购于Thermo公司；Caspase-3和LC3抗体购于CST公司.EZ-ECL购于BI公司.

1.2 细胞的培养

PC3细胞复苏后常规培养传代，培养于RPML1640+10%胎牛血清+100 U5mL-1青霉素和100 μg5mL-1链霉素的完全培养基中，置于37 ℃，5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱内，每2～3 d传代一次，取对数生长期细胞用于实验.

1.3 CCK-8细胞活力检测

胰酶消化对数生长的PC3细胞，制成密度为1.5×104mL-1的单细胞悬液，每孔种3×103个细胞于96孔细胞板内，每组设6个复孔.参照文献[7]的来氟米特剂量浓度，待细胞贴壁后，加入200 μL含来氟米特终浓度为50，100和150 μmol5L-1的完全培养基，细胞对照组只加入等量二甲基亚砜(0.1%)，空白组只加入等量的培养液，继续培养24，48和72 h后，每孔加入10 μL CCK-8，将细胞板放入培养箱中继续孵育2 h，在酶标仪上读取A450的数值，按下式计算药物对肿瘤细胞活力的影响：

1.4 流式细胞术检测细胞增殖时相分布

PC3细胞以1.5×105mL-1的密度接种于6孔板上，24 h贴壁后，加入终浓度为50，100和150 μmol5L-1来氟米特的完全培养基，每组各3个复孔，继续培养24 h.流式细胞仪检测细胞周期采用Cell Cycle Kit试剂盒.收集原细胞培养液(含全部悬浮细胞)，PBS洗涤贴壁细胞，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞，用收集的原细胞培养液终止消化，将细胞全部移至15 mL离心管中，800 r/min×5 min离心，去除上清,收集2×105～1×106个细胞用PBS重悬，再次800 r/min离心5 min，去除上清，用1 mL试剂A和10 μL试剂B重悬细胞，室温孵育30 min后进行流式细胞检测.

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

PC3细胞以1.5×105mL-1的密度接种于6孔板中，来氟米特共培养48 h,采用Annexin V/PI apoptosis kit试剂盒检测细胞凋亡.收集原细胞培养液(含全部悬浮细胞)，PBS 洗涤贴壁细胞，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞，用收集的原细胞培养液终止消化，将细胞全部移至15 mL离心管中，800 r/min×5 min离心，去除上清,PBS洗涤一次，收集1×105～5×105个细胞，用500 μL 1×binding buffer重悬细胞，加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI试剂，室温下避光孵育5 min,即上机检测.

1.6 蛋白印迹

细胞经药物处理后，用预冷的PBS洗2遍，按1 mL RIPA中性裂解液加10 μL PMSF的比例加入适量裂解液，冰上孵育30 min后，细胞刮刀收集至离心管中，4 ℃，12 000 r/min×20 min离心沉淀细胞，上清即为全细胞裂解液,二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量.20 μg蛋白煮沸后，12% SDS-PAGE电泳转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后加入一抗过夜，辣根过氧化物酶标记二抗孵育1～2 h后化学发光法显色.

1.7 细胞克隆形成实验

用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化对数生长的PC3细胞，制成单细胞悬液，按每孔1×103个细胞的密度接种于6孔培养板上,实验组细胞分别给予50，100和150 μmol5L-1来氟米特，对照组加0.1%二甲基亚砜，十字型交叉晃动培养基，使细胞分散均匀，培养箱内培养7 d,弃培养液，PBS洗2次，甲醇固定15 min,弃固定液，0.1%结晶紫染色10～20 min后用PBS缓慢洗去染液，晾干拍照.

1.8 统计方法

采用Graphpad Prism 6.0进行数据处理，数据以均值±标准差表示;采用SPSS18.0进行t检验和单因素方差分析,P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有非常显著性差异.

2 结 果

2.1 来氟米特对PC3细胞增殖的影响

倒置显微镜下观察，正常状态下的PC3细胞贴壁生长，呈不规则长梭形，多角形，上皮样，边缘光滑，立体感强，具有折光性.分别用不同浓度的来氟米特处理48 h后，细胞形态发生了明显改变，表现为随着来氟米特浓度的增大，细胞数目减少，细胞间隙变大，体积变小，细胞皱缩，变细长，呈纤维状生长，漂浮的细胞增多，并有变圆等凋亡形态改变(见图1(a)).用CCK-8法检测来氟米特对PC3细胞增殖的影响，结果表明，随着剂量增加和作用时间延长，来氟米特对PC3细胞增殖的抑制作用表现出时相性和量效依赖性(见图1(b)和(c)).

(a)细胞明场图

(b)细胞活力随LEF浓度的变化 (c)细胞活力随时间的变化

2.2 来氟米特对PC3细胞周期的影响

为了进一步确定细胞增殖抑制发生在哪一环节，用不同浓度的来氟米特处理PC3细胞24 h后进行细胞周期检测.结果显示，随着来氟米特浓度的增加，S期细胞比例明显增加，G1期和G2/M期细胞比例则相应减少(见图2(a)和(b))，提示细胞发生S期阻滞.

2.3 来氟米特对PC3细胞凋亡的影响

细胞凋亡是影响细胞活力的另一重要事件.不同浓度的来氟米特处理PC3细胞48 h，通过Annexin V-PI双染流式分析发现，随着来氟米特浓度的增加，细胞早期凋亡和晚期凋亡的比例逐渐增高.结果显示：150 μmol5L-1剂量组早期凋亡和晚期凋亡的比例分别是11.59%和4.88%；而50 μmol5L-1剂量组细胞早期凋亡和晚期凋亡的比例分别是3.15%和3.18%；100 μmol5L-1剂量组细胞早期凋亡和晚期凋亡的比例分别是6.58%和6.75%(见图3(a)).

(a)流式细胞周期图(FL2-A)

(b)细胞周期分布

(a)Western Blot分析Caspase-3的表达

(b)Annexin V-FITC和PI双染流式检测细胞凋亡

Caspase-3在细胞凋亡中具有重要的作用，Caspase-3的裂解表示Caspase-3的活化，能够比较敏感地反应细胞的凋亡程度.蛋白印迹检测显示，与对照组相比，Caspase-3的裂解随来氟米特浓度的增加而增加，提示高剂量的来氟米特促进PC3细胞凋亡(见图3(b)).

2.4 来氟米特对PC3细胞自噬的影响

在饥饿、低氧、药物等因素作用下，细胞会发生自噬，自噬与凋亡共同调控细胞死亡.某些情况下，自噬抑制凋亡，是细胞的存活途径；同时，自噬本身也会诱发细胞凋亡，或与凋亡共同作用调控细胞死亡.本研究发现，不同剂量的来氟米特处理均会触发细胞自噬，导致胞浆型LC3-Ⅰ剪切成为膜型LC3-Ⅱ(见图4(a)).而使用羟氯喹(HCQ)抑制自噬联合处理，则有效地增加了细胞的凋亡率(见图4(b)).这一结果表明，来氟米特触发的自噬发挥了抗凋亡的作用.

2.5 来氟米特对PC3细胞克隆形成能力的影响

克隆形成实验再次证明，来氟米特对PC3细胞具有抑制增殖的作用.将1×103个细胞种植在6孔板中，用二甲基亚砜作为对照，用含不同浓度来氟米特的培养基培养7 d后，用结晶紫染色观察克隆形成率.结果显示，与对照组相比较，随着来氟米特浓度的增大，克隆体积变小、数量变少(见图5).

(a)Western Blot分析LC3蛋白剪切

(b)Annexin V-FITC和PI双染流式检测细胞凋亡

LEF处理7 d，结晶紫染色图5 来氟米特使PC3细胞克隆形成能力下降

3 讨 论

本实验以PC3细胞为对象，探讨了来氟米特对前列腺癌细胞的影响.实验表明：来氟米特可以抑制PC3细胞增殖，并且具有时间-浓度依赖性，可使细胞发生S期阻滞；同时，来氟米特可以促进PC3细胞的凋亡.本实验同时发现，低剂量的来氟米特即可诱发PC3细胞发生自噬，抑制自噬发生会增强来氟米特的凋亡诱导效应.

来氟米特作为一种低毒、高效的新型免疫调节药，主要用于系统性红斑狼疮、银屑病、类风湿性关节炎等疾病的治疗和抗移植排斥反应，在病毒感染等其他领域也有广泛的应用[8-12].来氟米特及其活性代谢物A771726的主要作用机理是抑制嘧啶从头合成途径第4步反应中的关键酶DHODH的活性，以非竞争的方式阻断嘧啶合成，从而发挥抗增殖作用.正常细胞除了从头合成途径外还有补救合成途径，即利用细胞外的嘧啶碱基来合成细胞代谢所需的嘧啶核苷酸.来氟米特只能通过抑制DHODH的活性抑制嘧啶从头合成途径，但对补救途径没有影响.肿瘤细胞可通过补救途径来满足细胞代谢对嘧啶核苷酸的需求.

但来氟米特还存在不依赖DHODH抑制的其他途径来影响细胞增殖和凋亡.研究发现，来氟米特可显著抑制NF-κB活化，从而发挥抗炎抗纤维化的作用，并可藉此抑制CMV和BK等病毒的复制[12].此外，研究发现，高剂量来氟米特或其代谢物A771726可抑制多个酪氨酸激酶系统(如PDGFR，EGFR和JAK3)、丝/苏氨酸激酶系统(AKT,p70S6K1和PDK1)，降低细胞对细胞因子、丝裂原等的反应[1,4-6].来氟米特对DHODH及增殖相关激酶系统的抑制，表明其在肿瘤治疗中有一定的应用潜力.文献[13]在研究来氟米特抑制白血病细胞株K562生长机制中发现，来氟米特消耗细胞内的嘧啶核苷酸(UTP和CTP)，从而使细胞停止在S期.还有研究表明，来氟米特能诱导甲状腺癌细胞[14]、慢性淋巴细胞白血病细胞[15]、鼠白血病细胞[16]、人骨髓瘤细胞[17]和神经母细胞瘤细胞[7]发生G0/G1或S期阻滞.在这些研究中，来氟米特的作用跟剂量有关，不同剂量对细胞的增殖和凋亡有不同的影响.高剂量的来氟米特会显著诱导骨髓瘤和神经母细胞瘤细胞发生凋亡[7,17].

Hail等[18]在研究来氟米特对前列腺癌细胞株PWR-1E和DU-145抑制生长和促凋亡机制中发现，来氟米特抑制活性氧(ROS)的产生，抑制细胞的增殖.有趣的是，高剂量来氟米特增强ROS的产生，促进细胞凋亡.本实验使用前列腺癌PC3细胞，发现来氟米特浓度≥100 μmol5L-1时PC3细胞发生明显的S期增殖阻滞，150 μmol5L-1处理下PC3细胞才发生明显的凋亡作用，即：来氟米特在低剂量下主要诱导增殖阻滞，对凋亡影响较小；高剂量条件下，来氟米特可诱导细胞凋亡.本研究发现，来氟米特诱导的自噬是阻碍细胞凋亡的重要因素，因而自噬抑制剂可增强肿瘤细胞对来氟米特的敏感性.来氟米特的特性提示其更适合与其他药物搭配，通过不同的拮抗机理达成联合用药效应，用于肿瘤的预防和治疗.

总之，本研究表明来氟米特对前列腺癌具有增殖抑制和凋亡诱导作用，需要进一步研究其作用机制.同时，前列腺癌也存在不同的分型，包括雄激素依赖型和非依赖型等，因此，进一步揭示对来氟米特敏感的具体肿瘤亚型也是很有必要的，并在此基础上设计出针对前列腺癌的更佳的治疗药物.

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(责任编辑 薛 荣)

The effects of Leflunomide on cellular proliferation and apoptosis in PC3 cells

ZHOU Hua1, JIANG Kesheng1, HUANG Qiaoli1, CHEN Yicheng2, LI Yanming3, LI Tao1

(1.CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China; 2.SirRunRunShawHospitalofZhejiangUniversity,Hangzhou310031,China; 3.HuaiheHospitalofHe′nanUniversity,Kaifeng475000,China)

Leflunomide (LEF), an immunosuppressive drug, was generally used in the treatment of rheumatoid arthritis. Recently, increasing evidences indicated that LEF had an effective anti-proliferative effect on various tumors. To investigate the effect of LEF in prostatic cancer cells, prostatic cancer cell line PC3 was treated with solutions of LEF (0, 50, 100 and 150 μmol5L-1) and cultured in varied duration of time (24, 48 and 72 h). CCK-8 and cell clone forming experiments showed that when the concentration was ≥ 150 μmol5L-1, LEF significantly inhibited cell growth in a time- and dose-dependent manner. Annexin V-FITC/PI staining assay revealed that LEF induced S-phase cell cycle arrest, and enhanced cell apoptosis via modulation of Caspase-3 expression as shown by Western blotting experiments. Moreover, LEF could induce autophagy of PC3 cells, while hydroxychloroquine (HCQ) could enhance LEF-induced apoptosis by inhibiting autophagy. Taken together, LEF inhibited proliferation and promoted apoptosis of the PC3 cells.

Leflunomide; prostatic cancer; proliferation; apoptosis; autophagy

10.16218/j.issn.1001-5051.2017.01.012

2016-01-07；

2016-05-17

国家自然科学基金资助项目(31101057；31470082；81101929)；浙江省自然科学基金资助项目(LY14C120001)；浙江省公共创新平台实验动物项目(2014C37126)；浙江省卫生厅创新平台项目(2015RCA014)

周 华(1991-)，女，河南信阳人，硕士研究生.研究方向：动物细胞生物学.

李 涛.E-mail: litao@zjnu.cn

Q291

A

1001-5051(2017)01-0079-06