结核分枝杆菌硫酸化酶基因的克隆及其原核表达、鉴定及纯化

唐莉娟马 博刘 景周鸿淼张 振

(1.巴音郭楞职业技术学院,新疆库尔勒 841000;2.石河子大学动物科技学院,新疆石河子 832000;3.新疆疆南牧业有限公司,新疆喀什 843900)

结核分枝杆菌硫酸化酶基因的克隆及其原核表达、鉴定及纯化

唐莉娟1马 博1刘 景2周鸿淼1张 振3

(1.巴音郭楞职业技术学院,新疆库尔勒 841000;2.石河子大学动物科技学院,新疆石河子 832000;3.新疆疆南牧业有限公司,新疆喀什 843900)

本文拟对结核分枝杆菌ATP硫酸化酶基因进行原核表达，并鉴定其抗原性。根据结核分枝杆菌H37Rv ATP硫酸化酶（cysD）基因设计引物，扩增出大小约为999bp的目的基因片段。将PCR纯化产物克隆至PMD18-T中，构建重组质粒载体PMD18-T-cysD。以SacⅠ和HindⅢ双酶切重组载体PMD18-T- cysD 和表达载体pET-32a（+），并将纯化的cysD基因亚克隆至pET-32a（+）中，构建出原核重组表达质粒pET-32a-cysD。将pET-32a-cysD重组质粒转化至感受态细胞E.coli BL21（DE3）中，经IPTG诱导和SDS-PAGE分析，可见约55KD目的蛋白带。用Western blot分析方法鉴定该蛋白。结果显示纯化后所获得的融合蛋白与抗结核分支杆菌阳性血清发生特异性反应。表明研究成功构建了pET-32a-cys原核表达载体，纯化的融合蛋白具有良好的免疫原性。

结核杆菌 硫酸化酶基因 原核表达

据世界卫生组织估计，全世界约有三分之一的人口被结核菌感染，每年约有800万～1000万新增结核病患者中，大约有300万人因此而死亡[1]。1998年，法国巴斯德研究所完成了结核分枝杆菌H37Rv基因组全序列的测定工作，从而也是结核杆菌的研究进入了后基因时代，这使得在分子水平寻找新的抗结核靶点提供了可能。结核杆菌的硫代谢与它的毒力和氧化物耐受性有关，而ATP硫酸化酶能够活化硫代谢中的腺苷酰硫酸和焦磷酸反应，编码ATP硫酸化酶的基因就是cysD[3]。本研究拟克隆cysD基因并构建pET-32a-cysD重组质粒，进行诱导表达，对获得的目的蛋白进行抗原性分析，以期该重组蛋白为结核病诊断和寻找新的药物靶点提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株、质粒及其他试剂：结核杆菌菌株H37Rv由石河子大学人畜共患病实验室惠赠。载体PMD-18-T和pET-32a、大肠杆菌 BL21（DE3）和JM109为本实验室保存。Taq DNA聚合酶、SacⅠ、HindⅢ限制性内切酶、质粒提取试剂盒及胶回收纯化试剂盒等购自上海生工公司。

1.2 方法与结果

（1）引物。根据Genbank中序列，设计硫酸化酶cysD基因编码区上下游引物，由上海生工生物技术有限公司合成。P1：5-gag ctc atg gca ata acc ata aat atg gtc-3，P2：5-aag ctt tca gaa gta tcc ctg ccg c-3，

应用上述引物，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板进行PCR扩增，1.2%琼脂糖凝胶电泳，得到cysD大小约999bp的目的基因，与预期大小一致。

（2）cysD基因PCR扩增及表达载体的构建

结核分枝杆菌基因组DNA的提取，按照DNA快速提取试剂盒提供的说明书进行。以H37Rv基因组DNA为模板，应用上述引物，PCR扩增cysD基因，反应条件为94℃ 4min；94℃ 1min，56℃1min，72℃ 1min 循环30次；72℃延伸10min。PCR产物经酚氯仿法抽提、乙醇沉淀后，双酶切，1.5%的琼脂糖凝胶电泳回收、纯化后，与相同酶切的PMD18-T 载体连接，培养于氨苄西林琼脂平板，次日跳去克隆，提取质粒。挑取酶切鉴定正确的克隆由上海生工生物有限责任公司进行测序，阳性克隆命名为 pET-32acysD。

（3）pET-32a- cysD融合蛋白的表达。将pET-32a- cysD转化至DE3，涂布于含55μg/ml氨苄西林的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落进行PCR鉴定，将鉴定正确的菌斑接种于含30μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中，37℃摇菌过夜取200ul接种到100ml LB培养基中，37℃分别诱导0h，2h，4h，5.5h，6h，测定OD值分别是0.266、1.032、1.079、1.157、1.169。可见诱导重组菌相对大肠杆菌DE3和未诱导重组菌多出一条表达带，分子量约45KD（图1）。

图1 cyD重组质粒的蛋白表达鉴定

（4）pET-32a- cysD融合蛋白的Westernblot鉴定。将pET-32a-cysD以及阴性对照大肠杆菌DE3经SDS-PAGE后转移到PVDG膜上，可见诱导重组菌pET-32a- cysD在约55KD处明显被抗体所扑获。一抗共采用两种，一是抗His标签的单抗，另一种一抗是人的结核阳性血清，Western blot实验结果见图2。

图2 重组菌表达Western-Blot电泳结果

3 讨论

近十年来，多药耐药和广泛耐药型结核杆菌引起的肺结核病例越来越多。目前，寻找新的抗结核靶点以及相关药物成为抗结核药物研究领域的热点。自1998年结核杆菌的基因序列被破解以来，人们加深了对结核杆菌的认识，先后发现了大批新的抗结核靶点，其中不乏一些潜在的药物靶点。在结核杆菌中，结核杆菌的毒力和氧化物耐受性均受到硫代谢的影响，代谢中半脱氨酸的合成过程对结核杆菌的感染有正向调节的左右，这也为这也为抗结核菌药的筛选提供了新的靶标。另外，微生物的硫代谢途径大多不存在于人体内。因此，微生物的硫代谢途径被认为是一个有潜力的抗结核领域。

本实验构建了含有结核杆菌硫酸化酶cysD基因的原核表达载体pET-32a-cysD，并在大肠杆菌DE3中进行了诱导表达。原核表达要求简单且表达效率较高，结果显示pET-32acysD融合蛋白在低温诱导下为可溶性表达，并且Western-blot证实融合蛋白可与抗His标签的单抗、人的结核阳性血清特异结合。融合蛋白的成功表达，为应用硫酸化酶cysD基因进行下一步的研究奠定基础。

[1] Zhou M，Xie L，Yang Z，Zhou J，Xie J. HYPERLINK “http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27023679” Lysine Succinylation of Mycobacterium tuberculosis Isocitrate Lyase（ICL）fine-tunes the Microbial Resistance to Antibiotics[J].J Biomol Struct Dyn. 2016，（29）：1-40.

[2] Vladimirsky MA，Shipina LK，Makeeva ES，Alyapkina YS，Mikheev AY，Morozov VN. HYPERLINK “http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27021397”Application of water-soluble nanofilters for collection of airborne Mycobacterium tuberculosis DNA in hospital wards[J].J Hosp Infect.，2016，（2）：9.

[3] Peeling PW，Smith PG，Bossuyt PM. A guide for diagnostic e-valuations[J].Nat Rev Microbiol.，2006，4（12）：2-6.

[4] Cole ST，Brosch R，Parkhill J，et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence[J].Nature.，1998，393（6685）：537-544.

[5] Rachel Pinto，Quing Xui Tang，Warwick J. The Mycobacterium tuberculosis cysD and cysNC genes form a stress-induced operon that encodes a tri-functional sulfate-activating complex[J]. Microbiology.，2004，（150）：1681-1686.