羊传染性脓疱皮炎（Orf）耐热性活疫苗性能检测

冯玲霞张述斌蒙 琦张海明

(1.甘肃省畜牧兽医研究所,甘肃平凉 744000;2.华亭县动物疫病预防控制中心,甘肃华亭 744100)

羊传染性脓疱皮炎（Orf）耐热性活疫苗性能检测

冯玲霞1张述斌1蒙 琦1张海明2

(1.甘肃省畜牧兽医研究所,甘肃平凉 744000;2.华亭县动物疫病预防控制中心,甘肃华亭 744100)

为了确保疫苗的质量、安全性和有效性，以最大效率地提高接种后的效应作用，降低免疫接种后的不良反应。将生产的3批羊传染性脓疱皮炎（Orf）耐热性活疫苗冻干后，观察了其物理性状，并对疫苗进行了无菌检验、支原体检验、真空度检验、安全性检验、效力检验，以及剩余水分含量的测定。结果表明，生产的3批羊Orf耐热性活疫苗，对羊安全有效，其各项指标均符合标准，为合格疫苗，可放心使用。

羊传染性脓疱皮炎（Orf） 耐热性 活疫苗 性能指标 测定

羊传染性脓疱皮炎（Contagiousecthyma，CE）俗称“羊口疮（Orf）”，是由痘病毒科副痘病毒属的羊感染传染性脓疱皮炎病毒（orf virus，ORFV）引起绵羊和山羊的一种急性、高度接触性人兽共患传染病。该病传染性强，发病率高，尤以3～6月龄羔羊最为易感，且常呈群发性流行。通常发病率高达84.10%，死亡率为10%～40%左右，给养殖业造成很大的经济损失。本病的潜伏期为4～7d，发病后以口唇等处皮肤和黏膜丘疹、脓疱、溃疡并结成疣状厚痂为特征。传染源为病羊及隐性感染羊，尤其是病羊痂皮带毒时间长，是最危险的传染源。本病无明显的季节性，但以春季多发，一旦发生，常呈流行性。成年羊发病较少，呈散发，由于病毒抵抗力较强，羊群一旦被污染不易清除，可连续危害多年。给世界各国养羊业造成了巨大的经济损失，并对人类健康造成很大的威胁。而传统的活疫苗热稳定性和保护功能差，对冷链的要求高，2～8℃条件下，保存期只有3～6个月，大多需在-15℃以下保存，这给疫苗的储存和运输带来很大困难，容易因免疫失败而造成疫病的流行。

1 试验材料

1.1 试验用毒株

生产疫苗的HCE种毒由甘肃省畜牧兽医研究所鉴定、保管和供应。

1.2 试验用细胞

犊牛睾丸细胞由“羊传染性脓疱皮炎耐热性活疫苗的研究”项目组制备。

1.3 试验仪器

真空冷冻干燥机、Mettler Toledo DL31水分测定仪、高频火花真空测定器、高压蒸汽灭菌器、超净工作台、移液器、干燥箱等。

1.4 试验药品及试剂

1.4.1 羊Orf活疫苗耐热保护剂：由“羊传染性脓疱皮炎耐热性活疫苗的研究”项目组自行研制。

1.4.2 化学试剂：199培养基、水解乳蛋白、生理盐水、Frey培养基、硫乙醇酸盐培养基（T.G）、酪胨琼脂（G.A）等。

2 试验方法与结果

2.1 物理性状观察

试制的3批羊Orf耐热性活疫苗经冻干后，体积几乎没有变化，颜色一致，疏松多孔，保持原来的结构，未出现浓缩现象，呈微黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解，立即恢复原来的状态，且冻干前后病毒损失量不大。

2.2 无菌检验

2.2.1 试验方法：将生产的每批冻干苗随机抽取4支，用生理盐水稀释至原量，混合后接种硫乙醇酸盐培养基（T.G）小管及酪胨琼脂（G.A）斜面各2支，每支0.2mL，1支置于36±1℃恒温培养箱内培养；1支放置25±1℃培养，另设生理盐水和空白对照管，观察3～5d。

2.2.2 试验结果：经观察，接种疫苗的硫乙醇酸盐培养基（T.G）小管、酪胨琼脂（G.A）斜面及对照管在5d内均无细菌生长。

2.3 支原体检验

2.3.1 试验方法：每批冻干疫苗随机抽取4支，用生理盐水稀释至原量，混合后吸取5ml接种于小瓶改良的Frey培养基，再从小瓶中取0.2ml移植接种于1小管液体培养基内，将小瓶与小管同时放在37℃培养，每日观察培养物颜色变化。经5～7d后，培养物颜色未见变化，再从小瓶中取0.2ml移植于另一管液体培养基内，置37℃继续培养观察5～7d，如此重复3次，培养物颜色均无变化，在最后一次接种小管的培养物经14d观察后停止观察。如果在观察期内，发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化，pH值变化达±0.5时，应立即移植于小管液体培养基和固体培养基，观察在液体培养基中是否出现恒定的pH变化，及固体培养基上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。

2.3.2 试验结果：结果显示，在3次7d的反复培养和最后一次14d的培养中，小瓶和小管内的培养基颜色均无变黄或变红的现象，从而说明我们试制的三批疫苗均无支原体污染。

2.4 剩余水分测定

2.4.1 试验方法：采用真空烘干法。将准确称重的样品放60℃～70℃真空干燥箱内，在一定的减压条件下，用五氧化二磷干燥一定时间到恒重，样品减少的重量即等于含水量[2]。

计算公式：含水量%=（样品干前重-干后重）/干前重×100 2.4.2 试验结果：疫苗的剩余水分测定结果见表1。

表1 羊Orf耐热性活疫苗的剩余水分检验结果

结果表明，试制的3批羊Orf耐热性活疫苗的剩余水分含量均未超过4%，符合国家对冻干疫苗剩余水分含量的要求。

2.5 真空度检验

用高频火花真空测定器对试制的3批疫苗逐一进行真空度测定，结果3批耐热性羊Orf弱毒冻干活疫苗均出现紫色辉光，表明试制的疫苗真空度均合格。

2.6 安全性检验

2.6.1 试验方法：在平凉华亭县某羊场选用6月龄健康羔羊2只，分别将试制的3批苗每只于口腔黏膜接毒5个头份免疫剂量的耐热性羊Orf弱毒冻干活疫苗，观察10d。

2.6.2 试验结果：疫苗接种羔羊后，经观察，羔羊接种部位及口唇内均未出现红斑、水泡、脓疱、溃疡等病变，接种部位划痕在第3天完全消失。表明我们试制的3批疫苗安全检验均合格，不具有致病性。

2.7 效力检验

2.7.1 检验方法：每批疫苗随机抽取5瓶疫苗，按原量加生理盐水稀释混合后，用犊牛睾丸细胞测定其TCID50。要求疫苗TCID50≥10-5/0.1ml。

在平凉华亭某羊场购买6月龄左右的健康羔羊8只，隔离饲养，随机分成1个试验组和1个对照组，共2组，每组4只羔羊。试验组每只羔羊于口腔黏膜划痕接种试制的耐热性羊Orf弱毒冻干活疫苗0.1ml。21d后，对试验组和对照组的每只羔羊用100ID50HCE强毒口腔黏膜划痕攻击，观察10～15d。

2.7.2 检验结果：经测定，生产的3批羊Orf耐热性活疫苗的病毒感染力分别为：20150316批疫苗的TCID50在10-7.2；20150328批疫苗的TCID50在10-7.3以上；20150406批疫苗的TCID50在10-7.1。符合该疫苗TCID50≥10-5/0.1mL的要求。

经观察，对照组羔羊攻毒后，7d内全部在口唇部位出现羊口疮典型病变，免疫组经HCE强毒攻击后仅有2只羔羊于攻毒后第3d在攻毒部位出现轻微红肿，但随后红肿消失。其余羔羊均未出现任何羊口疮病变。结果见表2。

表2 羊Orf耐热性活疫苗对羔羊的保护效果

3 小结与讨论

通过对试制的3批羊Orf耐热性活疫苗各项性能指标的测定，表明其各项指标均符合《中华人民共和国兽用生物制品制造及检验规程》的规定，为安全合格疫苗，可放心使用。

羊Orf耐热性活疫苗的使用可有效控制羊Orf病的发生与流行，提高羊的生产性能，降低养殖风险，保障人民的身体健康。有利于减少羊Orf病对生态环境所造成的间接污染，可促进生态环境的良性循环，显示出了良好的应用前景，具有显著地社会效益和经济效益。

[1] 王文成.兽用生物制品耐热冻干保护剂的研究进展[J].畜牧兽医科技信息，2002，18（12）：7-10，15.

[2] 中华人民共和国兽用生物制品制造及检验规程[S].中华人民共和国农业部，2000：32-34.