基于石墨烯基复合物和聚天青Ⅰ的HRP传感器检测有机过氧化物的研究

丁绍卿，杨绍明，李玲玲，杨 杰，曹 嫱，查文玲

(华东交通大学 材料学院，江西 南昌 330013)



基于石墨烯基复合物和聚天青Ⅰ的HRP传感器检测有机过氧化物的研究

丁绍卿，杨绍明*，李玲玲，杨 杰，曹 嫱，查文玲

(华东交通大学 材料学院，江西 南昌 330013)

利用电化学还原氧化石墨烯(GO)的方法将石墨烯(rGO)固定在电极表面上，然后电沉积氢氧化铜和氢氧化镍复合物，构成石墨烯/金属氢氧化物复合纳米材料修饰的玻碳电极(GCE)，并通过电聚合天青Ⅰ将辣根过氧化酶(HRP)固定在GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2表面，制得GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA。对石墨烯/金属氢氧化物复合纳米材料进行了SEM和能谱表征。通过电化学阻抗法和循环伏安法对传感器的制备过程和电化学性能进行了研究，并进一步分别对过氧化氢叔丁基(BHP)及过氧化氢异丙苯(CHP)进行了分析测定。该传感器对BHP和CHP具有良好的检测效果，在2.0×10-5～9.2×10-4mol/L范围内响应电流与BHP浓度呈良好的线性关系，检出限为 9.9×10-6mol/L；在3.0×10-6～1.0×10-4mol/L范围内响应电流与CHP浓度呈良好的线性关系，检出限为 6.9×10-7mol/L。

石墨烯；金属氢氧化物；天青Ⅰ；有机过氧化物；HRP传感器

过氧化物被广泛用作纺织和造纸工业中的漂白剂、有机合成的氧化剂、环氧化剂、引发剂等，从而对环境造成了很大危害[1]。因此，分析检测过氧化物显得十分重要。目前，已报道的过氧化物检测方法有分光光度法、化学发光法以及色谱法等。但这些方法或样品处理过程繁杂，或检测设备价格高昂。采用电化学酶传感器对过氧化物进行分析检测可以克服上述缺点，且电化学传感器灵敏度高、选择性好和抗干扰能力强的特点使其能更好地实现对过氧化物的检测。基于辣根过氧化物酶(HRP)的电化学传感器在过氧化氢的检测中已得到广泛的应用，但在检测有机过氧化物方面的报道较少[2-3]。

石墨烯(rGO)修饰电极能降低过电位，促进电极表面的电子传递[4]，而且石墨烯修饰电极具有较高的稳定性和重现性，可对过氧化物进行测定。氢氧化镍(Ni(OH)2)和氢氧化铜(Cu(OH)2)是两种多功能材料，具有较好的电化学稳定性和电极兼容性，对有机物质具有强烈的吸附作用，并能促进有机分子的氧化，已广泛应用于氨基酸、葡萄糖和甲醛等的测定[5-9]。

天青Ⅰ是一种生物染料，单体在导电基质上具有良好的电子转移能力。将天青Ⅰ单体在电极表面聚合可得到导电性能好、稳定性好的聚天青Ⅰ(PA)电子介体薄膜[10-12]。制备生物传感器时，可以聚天青Ⅰ为电子媒介体，通过电化学聚合法将HRP固定在电极上，既能提高电极表面的电子传递速度，也可以提高酶电极的选择性和稳定性。

本文通过电化学还原的方法将rGO固定在电极上，然后通过电化学沉积Cu(OH)2-Ni(OH)2复合物在电极表面构建石墨烯/氢氧化铜-氢氧化镍(rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2)复合纳米材料。rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2复合纳米材料具有较大的比表面积和较强的吸附能力，能提高酶的附着量，也能较好提高电极的催化活性和稳定性，有利于HRP和PA电子介体的固定。最后通过电聚合天青Ⅰ将HRP固定于复合纳米材料修饰的电极表面，构建了用于有机过氧化物检测的生物传感平台，从而实现了对有机过氧化物的高灵敏、高选择性以及强抗干扰能力的快速检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

辣根过氧化物酶(250 U/mg，上海三杰生物技术有限公司)；过氧化氢叔丁基(BHP)、过氧化氢异丙苯(CHP)均购于国药集团化学试剂有限公司；硝酸铜(西陇化工股份有限公司)；天青Ⅰ(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；硝酸镍(天津市大茂化学试剂厂);CHI660电化学分析仪(上海辰华仪器公司)；JSM-6701型扫描电镜(日本电子JEOL公司)。实验用水为蒸馏水。

1.2 氧化石墨烯(GO)的制备

采用改进Hummers法[13]将石墨粉转化为GO。用分析天平称取2 g石墨粉，在0 ℃冰水浴下加入25 mL浓硫酸并搅拌使其充分混合后，向混合物中缓慢加入6 g五氧化二磷和5 g过硫酸钾，混匀并充分搅拌5 min。在80 ℃条件下水浴并持续搅拌3 h。反应结束后，加200 mL水进行稀释，抽滤，置于60 ℃下干燥得到预氧化石墨粉。

取1 g预氧化后的产物，在0 ℃冰水浴条件下，加入50 mL浓硫酸中充分搅拌至均匀。然后在0 ℃冰水浴条件下，边搅拌边缓慢加入1.2 g硝酸钾和6 g高锰酸钾，混匀后在35 ℃下持续搅拌2 h。再将混合物缓慢加入92 mL冰水中，边加边搅拌，于0 ℃冰水浴15 min。在35 ℃下恒温水浴搅拌2 h后，再将混合物加入装有280 mL水的大烧杯中冷却，之后，缓慢向溶液中加入30%的过氧化氢并不断搅拌至溶液变成亮黄色，静置，除去上层清液。用200 mL 10%的HCl洗涤3～4次，再用水离心洗涤3～4次后，在60 ℃条件下烘干得GO。

1.3 生物传感器的制备

按照文献对玻碳电极(GCE)进行预处理[14]，将预处理过的GCE置于事先超声分散好的1 mg/mL的GO溶液中，在-1.5～0.6 V电位区间以50 mV/s 循环扫描10圈，得到石墨烯修饰电极(GCE/rGO)。再将GCE/rGO置于含0.75 mmol/L Ni(NO3)2和0.25 mmol/L CuSO4的0.05 mol/L的NaNO3溶液中，以100 mV/s扫速于-1.2～1.2 V范围内循环扫描10圈在GCE/rGO上固定铜、镍的氧化物薄膜。之后将电极置于0.1 mol/L 的NaOH 溶液中，在-0.2～0.8 V 范围内以320 mV/s 的扫速扫描至稳定，重复上述过程1次后，用水漂洗制得石墨烯/氢氧化铜-氢氧化镍复合纳米材料修饰电极(GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2)[15]。将制备好的GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2电极置于含0.2 mmol/L天青Ⅰ和5 g/L HRP的pH 7.0的PBS溶液中，于-1.0～1.8 V电位范围内以100 mV/s循环伏安扫描3圈，再在-0.6～0.5 V 之间以50 mV/s循环扫描15圈[16]，得到GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA修饰电极。

1.4 电化学检测方法

电化学测试采用三电极体系：工作电极为玻碳电极(Φ=3 mm)或修饰电极，对电极为铂电极，参比电极为Ag/AgCl(饱和KCl)电极。在含0.1 mol/L KCl的5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1，体积比)的PBS溶液中进行交流阻抗扫描，对电极的修饰过程进行监控和表征；在优化实验条件下，于BHP和CHP的PBS缓冲溶液(0.2 mol/L，pH 7.0)中，进行循环伏安和计时电流测试，分别记录传感器对BHP和CHP的电流响应。

图1 GCE/rGO(A)、GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2(B)的SEM图以及GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2的能谱图(C)Fig.1 SEM images of GCE/rGO(A) and GCE/rGO/Cu (OH)2-Ni(OH)2(B)，and EDS spectrum of GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2(C)

2 结果与讨论

2.1 GCE/rGO及GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2的SEM与能谱表征

采用SEM对GCE/rGO(图1A)和GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2(图1B)进行表征。从图1A可以看出，通过电化学还原GO可将石墨烯固定在电极表面，石墨烯以褶皱状的形态分布在GCE表面。而在GCE/rGO上电沉积氢氧化铜-氢氧化镍复合纳米材料后得到GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2的SEM图(图1B)中，可观察到氢氧化铜、氢氧化镍颗粒均匀地分布在石墨烯表面，并在电极表面形成多孔隙结构。为了进一步确认铜、镍复合纳米材料在电极表面的固定情况，对GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2的能谱进行了分析(图1C)，从图中可以看到，能谱中有碳、氧、镍、铜元素的峰，说明石墨烯/氢氧化铜-氢氧化镍复合物已成功地修饰在电极表面上。

2.2 GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA的电化学阻抗表征

在含0.1 mol/L KCl的5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的PBS溶液中，不同修饰电极的电化学阻抗图谱见图2。从图2可以看出，GCE/rGO(曲线b)的阻抗明显小于GCE(曲线a)，主要是由于石墨烯固定在电极表面后促进了溶液中[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-与电极表面的电子传递。在GCE/rGO表面沉积氢氧化物复合纳米材料后(曲线c)，电子传递阻抗(Rct)增大，主要是由于金属氢氧化物的导电性比石墨烯差，使其阻抗略有增大。将GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2在含HRP的天青Ⅰ溶液中电聚合得到GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA(曲线d)，该电极的阻抗明显增大，说明在聚合过程中有大分子HRP固定在电极表面。

2.3 GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA的催化性能

修饰电极GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA对过氧化氢叔丁基催化性能的循环伏安曲线如图3所示。在pH 7.0 PBS中加入400 μmol/L的CHP后，氧化峰电流减小，还原峰电流增加，说明该修饰电极对CHP有良好的催化还原作用，可用于过氧化物的检测。

图2 不同修饰电极在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](含0.1 mol/L KCl)PBS溶液中的交流阻抗图谱Fig.2 EIS responses of different modified electrodes in 5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](containing 0.1 mol/L KCl) PBS solution a：GCE;b：GCE/rGO;c：GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2;d：GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA

图3 GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA在PBS溶液中的CV图Fig.3 Cyclic voltammograms of GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA a:pH 7.0 PBS，b：PBS+400 μmol/L BHP;scan rate:100 mV/s

图4 不同pH值的PBS溶液对修饰电极检测效果的影响Fig.4 Effects of different pH values of PBS solution on detection of modified electrode

2.4 pH值对GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA检测效果的影响

考察了GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA在不同pH值的PBS溶液中对BHP的检测效果。将修饰电极置于pH 6.0～8.0的PBS溶液中，检测其对60 μmol/L BHP的电流响应。如图4所示，响应电流随着pH值的增大先增大后减小，当pH值为7.0时，修饰电极对BHP的电流响应最大，说明此时HRP的活性最大，检测效果最好，因此实验选择pH 7.0的PBS溶液作为检测底液。

2.5 电位对GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA检测效果的影响

在不同工作电位下，采用计时电流法考察了传感器在pH 7.0的PBS溶液中对60 μmol/L BHP的电流响应。结果显示，在-0.05～-0.3 V电位范围内，响应电流值随着工作电位的增大而不断增大，这是因为工作电位越负，过氧化氢越易被还原，加快了电子在电极表面与固定在PA电子介体薄层中的HRP活性中心之间的传递。但随着电位负移达到一定程度，响应电流开始变化缓慢，且电极也不稳定。在-0.25 V工作电位下修饰电极对BHP有较好的检测效果，且电极比较稳定。综合考虑，选择-0.25 V作为最佳工作电位。

2.6 不同修饰电极对有机过氧化物的检测效果

采用计时电流法研究了不同修饰电极在pH 7.0的PBS中对60 μmol/L BHP的电流响应。实验结果显示，在-0.25 V电位条件下，不同修饰电极的电流响应大小顺序为：GCE

2.7 GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA对过氧化物的检测分析

在优化实验条件下，利用GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA分别对BHP及CHP进行测定。在-0.25 V电位下，于pH 7.0 PBS溶液中分别连续滴加一定浓度的BHP及CHP。I～t曲线结果表明，响应电流值与BHP浓度在2.0×10-5～9.2×10-4mol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为I(A)=1.04×10-6+ 0.000 48c(mol/L)(r=0.999)；灵敏度为0.000 48 A·mol/L，检出限(S/N=3)为9.9×10-6mol/L。响应电流值与CHP浓度在3.0×10-6～1.0×10-4mol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为I(A)= 1.11×10-6+0.009 1c(mol/L)(r=0.999)；灵敏度为0.009 1 A·mol/L，检出限为6.9×10-7mol/L。

2.8 GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA修饰电极的重现性与稳定性

在相同实验条件下，采用同一支玻碳电极5次制备GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA修饰电极，测得其对60 μmol/L BHP的响应电流的相对标准偏差(RSD)为6.5%。采用同一支修饰电极5次测量同一浓度的BHP，响应电流的RSD为4.2%。表明该修饰电极具有较好的稳定性和重现性。

2.9 干扰实验与实际样品分析

采用抗坏血酸(AA)、葡萄糖(Glu)、尿素(UA)、甘氨酸(Gly)、L-酪氨酸(L-Try)研究了GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA的抗干扰性能。在pH 7.0 的PBS中先加入40 μmol/L 的BHP，再依次加入5倍BHP浓度的葡萄糖、尿素、甘氨酸和L-酪氨酸，观察该修饰电极对加入物质的电流响应。结果表明，在实验条件下，Glu，UA，Gly和L-Try对过氧化物检测的影响可以忽略。另外，BHP和CHP共存时的相互允许量为：检测40 μmol/L BHP时，CHP的量不超过0.65 μmol/L；检测40 μmol/L CHP时，BHP的量不超过33.4 μmol/L。

为了研究该传感器的实用性，以孔目湖水为样品，对其进行加标回收实验。经该传感器检测，孔目湖水样中未检出过氧化物，3个加标水平(50.0，60.0，90.0 μmol/L)下的回收率分别为100.2%，99.7%和98.7%；RSD(n=3)分别为3.5%，4.3%和1.2%。

3 结 论

本文利用电化学还原GO的方法将石墨烯固定在电极表面上，再沉积氢氧化铜和氢氧化镍复合物，构建石墨烯/金属氢氧化物复合纳米材料修饰的玻碳电极，通过电聚合天青Ⅰ将HRP固定在GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2表面制得GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA。通过电化学阻抗法和循环伏安法对传感器的制备过程和电化学性能进行了研究，并采用该传感器对过氧化物的检测条件进行了优化。在优化实验条件下，该传感器对BHP和CHP具有良好的检测效果，对BHP和CHP的线性范围分别为2.0×10-5～9.2×10-4mol/L和3.0×10-6～1.0×10-4mol/L。该传感器具有良好的稳定性和抗干扰性能。

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Study on Determination of Organic Peroxides with HRP Sensor Based on Graphene Nanocomposites and Poly Azure Ⅰ

DING Shao-qing,YANG Shao-ming*,LI Ling-ling,YANG Jie,CAO Qiang,ZHA Wen-ling

(School of Materials Science and Engineering,East China Jiaotong University,Nanchang 330013,China)

In this paper,graphene(rGO) was immobilized on the surface of the electrode by the method of electrochemical reduction of graphene oxide(GO),and then the copper hydroxide-nickel hydroxide nanocomposites were electrodeposited to form graphene/metal hydroxide nanocomposites modified glassy carbon electrode(GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2).Finally,horseradish peroxidase(HRP) was immobilized onto the surface of the above prepared electrode by electropolymerizing azure I to form the GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA(PA:poly azure Ⅰ).The graphene/metal hydroxide nanocomposites were characterized by SEM and EDS.The preparation process and electrochemical performance of the sensor were investigated by electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry.Hydrogen peroxide tert-butyl(BHP) and cumene hydroperoxide(CHP) were determined by the sensor.The linear response of the HRP sensor to BHP was in the concentration range of 2.0×10-5-9.2×10-4mol/L with a detective limit of 9.9×10-6mol/L and that to CHP was in the concentration range of 3.0×10-6-1.0×10-4mol/L with a detective limit of 6.9×10-7mol/L.

graphene;metal hydroxides;azure I;organic peroxide;HRP sensor

2017-01-17；

2017-03-01

国家自然科学基金项目(21465012)；江西省自然科学基金项目(20171BAB203017)；江西省教育厅科技项目(GJJ150544)；华东交通大学校立项目(15LX03)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.07.004

O657.1;O611.62

A

1004-4957(2017)07-0865-05

*通讯作者：杨绍明，博士，教授，研究方向：电分析化学及生物传感器，Tel：0791-87046336，E-mail：yangsm79@163.com