昆明市区虎皮鹦鹉源大肠杆菌毒力基因及耐药基因的流行病学特征

2017-08-01吴海滨戴开娜魏学林吴培福

中国兽医杂志 2017年6期

关键词：虎皮毒力致病性

杨娟，吴海滨，戴开娜，魏学林，吴培福

(1．西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224;2．大寨乡人民政府畜牧兽医站，云南金平 661511)

昆明市区虎皮鹦鹉源大肠杆菌毒力基因及耐药基因的流行病学特征

杨娟1，吴海滨1，戴开娜2，魏学林1，吴培福1

(1．西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224;2．大寨乡人民政府畜牧兽医站，云南金平 661511)

为研究大肠杆菌毒力基因和耐药基因的流行病学特征对大肠杆菌病的防控，从昆明市花鸟市场采集虎皮鹦鹉粪样，从中分离鉴定大肠杆菌，并对12种毒力基因及22种耐药基因的携带情况进行了检测。结果从虎皮鹦鹉粪样中共分离鉴定出47株大肠杆菌;feo B、tra T、fim A基因携带率都为100%;不携带cva C基因。41．67%的毒力基因检出率在50%以上。对耐药基因而言，除氨基糖苷类药物的aac(3)－Ia基因、β－内酰胺类药物的OXA、SHV基因未检出外，其余耐药基因均呈阳性。试验结果可为虎皮鹦鹉大肠杆菌病的预防提供理论支持和实践借鉴。

虎皮鹦鹉;大肠杆菌;毒力基因;耐药基因

大肠杆菌病是一种全世界范围内流行的人兽共患病之一，具有广泛传播性和重要的公共卫生学意义。大肠杆菌的致病性和耐药性分别与其携带毒力基因和耐药基因的种类、数目存在相关性［1，12］。虎皮鹦鹉作为观赏鸟类，在全世界分布广泛，同样亦对致病性大肠杆菌敏感［2－4］，特别是幼龄鹦鹉感染性更高，但目前很少见到虎皮鹦鹉粪便大肠杆菌毒力基因及耐药的研究报道。因此，本试验在分离鉴定虎皮鹦鹉粪便大肠杆菌的基础上，对分离株毒力基因的流行病学特征及耐药基因携带率进行研究，可为大肠杆菌病的防控提供理论指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料虎皮鹦鹉(2016年6～7月采集于昆明市4个市区7个花鸟市场，共83个粪样);LB固体培养基、伊红美蓝培养基、蛋白胨、酵母粉，均购自昆明硕阳科技有限公司。

1.2 大肠杆菌平板菌落计数称取0．1 g虎皮鹦鹉粪样于 PE管中，用蛋白胨缓冲液进行10－4～10－6倍稀释，取20μL接种于伊红美蓝培养基上培养18～24 h后进行平板菌落计数。

1.3 大肠杆菌分离与鉴定本研究用伊红美蓝培养基初步筛选大肠杆菌，后利用生化试验和PCR技术进一步鉴定大肠杆菌。PCR鉴定(Uid和16S rRNA基因)所用引物参见文献［5－6］。生化试验包括:糖发酵试验(葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖)、明胶液化试验、硫化氢试验、吲哚(靛基质)试验、甲基红(M.R.)试验、V－P试验、枸橼酸盐利用试验、尿酶试验、淀粉水解试验、硝酸盐还原试验。

1.4 毒力基因及耐药基因的扩增通过全菌裂解法提取大肠杆菌基因组DNA，并对12种毒力基因的流行情况和22个耐药基因携带情况进行检测。12种毒力基因包括:feo B、tra T、fim A、fyu A、irp－2、ro N、iuc C、tsh、iut A、iss、cva C和pap C，其扩增引物及参数参考文献［1］;22种耐药基因包括:磺胺类耐药基因(sul1、sul2、sul3);四环素类耐药基因(tet A、tet B);氨基糖苷类耐药基因［aac C2、aac C4、aad Al、aad A2、aac(3)－Ia、aac(3)－IIa、aph(3)－IIa］;氯霉素类耐药基因(Catl、Cml A、Flor);β-内酰胺类耐药基因包括(CTX－M、SHV、OXA、TEM);喹诺酮类基因包括Qnr S;其他基因Gyra(QRDR)、Aac(6')-Ibcr。扩增引物及参数参考文献［7］。引物由铂尚生物技术有限公司合成。

2 结果与分析

2.1 虎皮鹦鹉粪便大肠杆菌活菌计数从每个区花鸟市场采集虎皮鹦鹉粪样，用伊红美蓝培养基进行平板菌落计数，得出:盘龙区、五华区、西山区、官渡区虎皮鹦鹉粪便中大肠杆菌平均数分别为: 1.61×108CFU/g、4.90×108CFU/g、2.03×106CFU/g、3．78×108CFU/g。从中可以看出，五华区虎皮鹦鹉粪便中大肠杆菌数最多，西山区最少。

2.2 大肠杆菌分离鉴定本试验总共分离到71株细菌，最终鉴定出47株大肠杆菌，检出率为66.20%。分离的大肠杆菌在伊红美蓝培养基上为黑色带金属光泽的菌落;革兰染色均为阴性，生化鉴定为:能发酵蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖产酸产气，能利用硝酸盐，不产生硫化氢，不分解尿素和淀粉，不液化明胶，M.R.和吲哚呈阳性，V－P试验和枸橼酸盐利用试验为阴性，均符合大肠杆菌的生化特性。大肠杆菌两种基因的PCR鉴定均为阳性，条带大小与预计大小一致。

2.3 大肠杆菌毒力基因分布本试验对47株大肠杆菌12个毒力基因进行检测，结果见表1。feo B、tra T及fim A基因检出率都为100%;未检出cva C基因。41．67%的毒力基因检出率在50%以上。

表1 大肠杆菌相关毒力基因的分布

2.4 毒力基因数量分布情况本试验中每株大肠杆菌同时携带不少于3种毒力基因，20株同时携带7～9种毒力基因。9株同时携带6种毒力基因，携带率最高(19．15%)(见表2)。

在HPI强毒力岛标志基因方面，fyu A+irp－2的检出率为31．92%。3株同时携带 iss、irp－2、pap C、tsh 4种毒力基因。27株至少含有2种以下毒力基因:iut A、iss、tsh、iro N、irp－2。

表2 毒力基因数量分布情况

2.5 虎皮鹦鹉肠道大肠杆菌耐药基因检测采用已建立的PCR方法，对47株E．coli分离株进行22种耐药基因的检测(见表3)。Qnr S的检出率最高(100%);aac(3)－Ia、OXA和SHV基因均未检出。在耐磺胺类药物的基因中，sul2基因的检出率最高(80．85%);四环素类药物以tet A基因的检出率最高，为74．67%;氨基糖苷类以aad Al基因的检出率最高，为63．83%;氯霉素类以Catl基因的检出率最高，为97．87%;β－内酰胺类以TEM基因的检出率最高，为89．36%。

本试验中，分离株均携带5种以上耐药基因，最大携带量为17，46株携带耐药基因的量在8种以上，占全部菌株的97．87%。

表3 耐药基因检率

3 讨论

3.1 大肠杆菌菌落计数及鉴定试验结果表明，昆明市五华区鹦鹉肠道粪便中大肠杆菌的菌落数最高，西山区最低，这可能与动物的饲养环境、食物种类、卫生状况等因素有关。五华区花鸟市场属于昆明市较大的花鸟市场，动物种类多，客流量大，可能会促进大肠杆菌的传播。西山区动物种类较少，偏向于花卉贸易，降低了大肠杆菌的传播几率。

本试验总共分离出71株细菌，最终鉴定出47株大肠杆菌。研究结合分离株的菌落特征、生化特征及PCR技术来鉴定大肠杆菌，因而，大肠杆菌的鉴定结果较可靠，满足后续试验的要求。

3.2 大肠杆菌毒力基因与耐药基因的流行特征研究表明，大肠杆菌致病性与所其携带的毒力基因密切相关［8］，涉及的基因主要有 iut A、tsh、iro N、cva C、ast A、iss、irp2、pap C、iuc D、vat等。董向磊研究认为，在iut A、iss、tsh、iro N、irp－2、cva C 6种毒力基因中，如果APEC分离株同时携带有2种以上毒力基因，则有89．74%的概率认定该分离株具有致病性，误差率为7．90%［1］。为此，本文研究了鹦鹉源大肠杆菌毒力基因的流行特征。以往研究［9－12］对APEC的毒力基因进行了检测，认为耶尔森菌强毒力岛(HPI)摄铁系统与致病性密切相关，是决定细菌的致病性重要的原因之一，irp2和fyu A是HPI的核心基因。本试验中毒力基因的检出率均明显低于以往的报道，说明多数分离株的致病性可能较弱或没有致病性。在以往试验中，研究菌株分离自发病禽类，而本试验粪样来自于非发病禽，因而毒力基因检出率偏低，但并不能说明鹦鹉不携带致病性菌株，某些菌株携带毒力基因的种类较多(如4株分离株同时携带有 iut A、iss、tsh、iro N和irp－2基因)，具有一定的潜在致病性，因而，在鹦鹉大肠杆菌病的防治过程中不容忽视，特别是在环境复杂的花鸟市场应加强卫生管理。

随着抗生素的应用，大肠杆菌耐药性日益严重，且其耐药谱不断增宽。大肠杆菌耐药性与其耐药基因的携带率有明显的相关性，为此，耐药基因的检测对生产实践有重要的指导意义。在本试验中，分离株耐药基因的携带率比张济培［14］和张忠［7］的报道偏高，这可能与饲料中抗生素残留和滥用抗生素有关。

综上所述，昆明市区花鸟市场粪便大肠杆菌毒力基因携带率低，但耐药基因的携带率较高。然而，虎皮鹦鹉是目前常见的宠物鸟之一，与人类接触频繁，大肠杆菌的毒力基因与耐药基因很可能传播到人类。本论文试验结果可为虎皮鹦鹉大肠杆菌病的预防提供理论支持和实践借鉴。

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