河北保定地区羊多头蚴和犬多头带绦虫的调查与鉴定

于合宅

(河北省望都县畜牧水产局，河北 保定 072450)

河北保定地区羊多头蚴和犬多头带绦虫的调查与鉴定

于合宅

(河北省望都县畜牧水产局，河北 保定 072450)

为了解河北省山羊多头蚴和犬多头带绦虫的感染情况，本研究对河北省涞源县、阜平县和易县的山羊和犬进行绦蚴虫感染情况调查，并通过PCR技术对多头蚴与多头带绦虫分离株线粒体pnad1基因部分序列进行扩增与分析，确定多头蚴和多头带绦虫之间的种系发育关系。结果显示，调查区域山羊多头蚴与犬多头带绦虫感染率分别为2.38%和15.33%，通过DNAStar软件分析，所获得多头蚴和多头带绦虫分离株分别与四川多头带绦虫分离株的相似性分别为98.9%～99.5%和99.5%～99.8%，确定羊多头蚴为犬多头带绦虫的幼虫。

多头蚴;多头带绦虫;调查;pnad1基因;鉴定

羊脑包虫病由脑多头蚴(Coenurus cerebralis)引起，而脑多头蚴是多头带绦虫(Taenia multiceps)的中绦期幼虫。脑多头蚴寄生于山羊、绵羊、牛和骆驼等有蹄动物的大脑、延脑与脊髓等神经系统，引起致死性脑多头蚴病，人也可以感染［1］，多头带绦虫寄生于犬、狼和狐狸等犬科动物小肠内。该虫种呈全世界分布，主要见于亚洲、非洲和欧洲等国家和地区，在我国主要以西北、东北和华北等广大牧区较为常见，且近几年动物感染率呈逐渐上升趋势［2］。目前河北省尚无关于山羊多头蚴感染情况的调查与种类鉴定。因此，本研究通过对河北省部分地区山羊多头蚴和犬多头带绦虫感染情况进行调查，提取多头带绦虫头节和多头蚴虫体DNA，对线粒体pnad1基因进行扩增与分子鉴定，为该地区多头蚴/多头带绦虫病的防制提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 调查范围及样品数量 2016年4月－2016年10月，对河北省涞源县、阜平县和易县3个县区的6个羊场共546头山羊和羊场附近的流浪犬、家犬等共150只进行绦虫蚴病感染情况调查。

1.2 调查方法 通过询问羊场畜主与羊群发病的情况，包括羊群的数量、发病头数、临床表现、发病史、治疗药物与效果等，对疑似患有多头蚴病的山羊进行观察与触诊，确定其体表、胸腔、腹部及脑部是否存在肿块。

1.3 检查方法 采用完全解剖法，对山羊皮下、肌肉、腹腔、大脑和脊髓等部位进行逐一检查。对犬只进行禁食12 h，投喂含有氢溴酸槟榔碱(7.5 mg/kg体重)的肉块进行体内驱虫，于1 h后收集犬排出的粪便，对分别进行无害化处理后收集多头带绦虫节片，进行形态学鉴别后统计荷虫数。

1.4 绦蚴虫的分子鉴定与种系发育关系分析 对获得的绦蚴虫样品进行分子生物学鉴定，用Omega生物技术公司生产的DNA提取试剂盒提取绦蚴虫的DNA基因组，本试验以PCR技术对绦蚴虫线粒体pnad1基因序列进行扩增，通过序列分析对绦蚴虫进行分子学鉴定。其中扩增引物利用汤国祥等［3］设计的引物，其中上游引物:Nad1-F:5'-GGGTTATTCTCAGTTTCGTAAGGGC-3'(25 bp)，下游引物Nad1-R: 5'-ATACATATTACGTACAAGATTA-3'(22 bp)，引物委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。采用25 ul扩增体系:双蒸水13.75 uL，2×Taq PCR Master Mix 8.75μL，上下游引物(50 pmol/L)各0.25μL，模板DNA 2μL，混匀后低速离心，并作空白对照。反应条件为:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，37个循环，72℃后延伸5 min。扩增产物于4℃保存。

取5μL扩增产物进行1%凝胶电泳，将阳性样品回收后送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，将测定的序列与GenBankTM收录的同源序列进行同源性对比，利于DNAStar软件分析序列之间差异。

2 结果

2.1 不同地区山羊多头蚴与犬多头带绦虫感染情况结果 通过对山羊进行剖检与犬药物驱虫结果来看，多头蚴病感染率为2.38%，感染强度为1～9;多头带绦虫感染率为15.33%，感染强度为3～12，见表1和表2。

2.2 不同地区山羊多头蚴和犬多头带绦虫感染强度调查结果 见表2。

表1 不同地区山羊多头蚴和犬多头带绦虫感染率调查情况

表2 不同地区山羊多头蚴和犬多头带绦虫感染强度调查结果

2.3 不同生长阶段羊多头蚴感染情况 通过分析不同生长阶段羊群感染多头蚴病的特点，发现各生长阶段羊群都可以感染多头蚴病，但以6月龄以下羊群感染率稍高，而12月龄以上羊群感染强度则相对较大，见表3。

表3 不同生长阶段羊多头蚴感染情况

2.4 PCR扩增结果 随机从6个地区分别抽取多头蚴和犬多头带绦虫样品各1份，共对12个样品均成功扩增出约520 bp的条带，且无非特异性条带，与预期扩增目的片段相符，空白对照为阴性。选择全部样品中6个样品进行凝胶电泳(如图1)。

图1 多头蚴和多头带绦虫线粒体pnad1基因序列PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析M:DL-2 000相对分子质量标准;1～6:DTY1、DTY2、DTY3、DTT1、DTT2和样品DTT3;7:阴性对照

2.5 测序与序列分析结果 经测序结果显示，去掉引物片段后，所获得的绦蚴虫线粒体pnad1基因片段均为516 bp，6个多头蚴和多头带绦虫分离株线粒体pnad1基因序列相似性分别为99.2%～99.8%和99.8%～100%，与四川多头带绦虫分离株(登录号:KC794810.1)的相似性分别为98.9% ～99.5%和99.5%～99.8%，与带属其他绦虫的相似性均分别低于90.4%和90.8%。结果显示，此次研究获得的多头蚴和犬多头带绦虫分离株均属于多头带绦虫。

3 讨论

本次调查结果显示，河北省部分地区山羊多头蚴病感染率为2.38%，低于李连芳［4］报道的青海省牛、羊多头蚴感染率(3.01%和1.44%)，高于戴荣四［5］等对湘西自治州不同地区山羊多头蚴病感染率(5.31%)和夏晨阳［6］等对西藏地区绵羊多头蚴病感染率(4.26%)。犬多头带绦虫病感染率为15.33%，感染强度为1～16条，低于许正林［7］等报道的青海省天俊地区犬多头带绦虫病感染情况(感染率为6.38%，平均感染强度为14.67条)，高于戴荣四［8］等对湖南省怀化地区犬多头带绦虫病感染情况(感染率为25.0%，感染强度为2～14条)。对于不同生长阶段羊群来看，6月龄以下的羊群多头蚴病感染率最高，但是与夏晨阳［6］等调查结论有所差异(成年绵羊的多头蚴病感染率最高)。由以上可知，不同地区绦蚴虫病感染情况均有较大差异，这除了与当地养殖场卫生环境、饲养模式、绦蚴虫病防疫和样品采集时间、地点和数量密切相关以外，还与当地政府与养殖户对绦蚴虫病的防制重视程度密切相关。

本次试验首次在对河北省部分地区进行羊多头蚴和犬多头带绦虫感染调查的基础上对羊绦蚴虫进行线粒体pnad1基因序列进行扩增与种系发育分析。结果显示，扩增所获得的河北省3个不同地区6个羊多头蚴和犬多头带绦虫分离株线粒体pnad1序列长度一致，为516 bp，但不同分离株之间存在一定的遗传差异，其中多头蚴分离株之间种内差异为0.2%～0.8%，而多头带绦虫分离株之间种内差异偏小，为0%～0.2%。多头蚴和多头带绦虫分离株与GenBank收录的四川多头带绦虫分离株(登录号:KC794810.1)的同源性分别为98.9% ～99.5%和99.5%～99.8%，与带属其他绦虫的相似性均分别低于90.4%和90.8%。结果显示，此次研究获得的多头蚴和多头带绦虫分离株均属于多头带绦虫，本试验为羊多头蚴与犬多头带绦虫病的诊断、防制及进一步分子学研究奠定基础。

［1］ 杨光友，张志和．野生动物寄生虫病学［M］．北京:科学出版社，2013:386-389．

［2］ 李文卉，付宝泉．脑多头蚴病研究进展［J］．动物医学进展，2010，31(30):81-91．

［3］ 汤国祥，刘笛秋．山羊脑多头蚴线粒体nad1基因的克隆及序列分析［J］．中国畜牧兽医，2011，38(9):87-90．

［4］ 李连芳．青海省牛羊多头蚴病流行情况调查［J］．青海畜牧兽医杂志，2011，41(1):25-26．

［5］ 戴荣四，李芬，刘伟，等．湘西地区山羊多头蚴感染情况调查与种类鉴定［J］．中国人兽共患病学报，2009，25(4):391-394．

［6］ 夏晨阳，刘健枝，次仁多吉，等．西藏家畜三种绦虫蚴病感染情况的调查［J］．中国兽医科学，2014，44(11):1 205-1 209．

［7］ 许正林，李福寿．犬多头带绦虫感染情况调查［J］．青海畜牧兽医杂志，2009，39(3):28．

Epidemic survey and identifiaction of Coenurus and Taenia multiceps in parts areas of Hebei province

YU He-zhai

(The animal husbandry and Fisheries bureau of WangDu County，Baoding 072450，China)

The aims of the present study were to investigate the prevalence of Coenurus in goats and Taenia multiceps in dogs in Hebei province．We examined the infections of Coenurus and Taenia multiceps in Laiyuan，Fupin and Yi counties in Hebei province．The survey showed that the prevalence of Coenurus and Taenia multiceps was 2．38%and 15．33%，respectively．In addition，the target gene(nad1)of Coenurus and Taenia multiceps was amplified by PCR to analyze the nad1 genetic difference between them．It was showed that the sequence similarity of Coenurus and Taenia multiceps with the sequence of Taenia multiceps available in Genbank was 98．9－99．5%and 99．5－99．8%，respectively．It is confirmed that Coenurus of the goats belongs to the larva of Taenia multiceps．

Coenurus;Taenia multiceps;Investigation;nad1 gene;Identification

2016-12-16

于合宅(1965-)，男，高级兽医师，本科，从事兽医技术推广工作，E-mail:1321545275@qq．com

R383．3

A

0529-6005(2017)06-0018-03