宁夏不同绵羊品种中绵羊肺炎支原体的调查

谢秀兰，额尔和花，黎 帅，马小明，黎玉琼，李颖康

(1．宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏 银川 750002;2．宁夏大学新华学院，宁夏 银川 750021)

宁夏不同绵羊品种中绵羊肺炎支原体的调查

谢秀兰1，额尔和花1，黎 帅2，马小明1，黎玉琼1，李颖康1

(1．宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏 银川 750002;2．宁夏大学新华学院，宁夏 银川 750021)

为了解绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)在不同品种绵羊中的感染情况，项目采集宁夏盐池、平罗两地的4个绵羊品种(滩羊、陶寒杂、杜寒杂和滩寒杂)的鼻拭子标本403份，提取DNA并用绵羊肺炎支原体特异性PCR进行检测，统计不同品种、年龄段绵羊体内绵羊肺炎支原体的检出情况。结果表明，滩羊、陶寒杂、杜寒杂和滩寒杂的绵羊肺炎支原体的检出率依次为52．0%、83．0%、75．5%和85．7%;滩羊在3月龄以下及8月龄以上的检出率最低，分别为24．2%和34．4%，3月龄至8月龄的检出率为94．3%;陶寒杂、滩寒杂在各年龄段的检出率均在74．0%以上;杜寒杂3月龄以下的检出率为56．3%，3月龄以上的检出率在82．0%以上。结果表明，宁夏地区规模化饲养的绵羊中，绵羊肺炎支原体广泛存在，较滩羊而言，其他杂交品种羊更易感染绵羊肺炎支原体。

宁夏地区;滩羊;绵羊肺炎支原体;PCR

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)引起绵羊和山羊的非典型性肺炎，该病呈急性或慢性经过，病死率一般为15%～30%，有时高达60%～80%［1-2］。有研究表明，由绵羊肺炎支原体引起的肺炎在不同绵羊品种中的发病率不一［3-4］。宁夏地区主要饲养滩羊、小尾寒羊、蒙古羊、萨福克羊、特克塞尔羊、杜泊羊及以上品种杂交产生的杂种羊，绵羊支原体性肺炎是该地区的高发病。为了进一步分析绵羊肺炎支原体在宁夏不同绵羊品种中的感染情况，本试验应用PCR方法对滩羊及杂交羊中绵羊肺炎支原体感染情况进行了调查，旨在为进一步分析该病原对宿主感染的差异，以及制定有效的防制措施提供有用的信息。

1 材料

1．1 样本 随机采集宁夏盐池、平罗两地的滩羊和杂交羊(滩寒杂、杜寒杂、陶寒杂)的鼻拭子标本，每个群体分3个年龄段(3月龄以下，3－8月龄，大于8月龄)，采集33～35例，共403份。鼻拭子标本浸入无菌生理盐水中，4℃保存。

1．2 菌株 绵羊肺炎支原体标准株Y98由中国农业科学院兰州兽医研究所逯忠新、储岳峰老师惠赠。

1．3 试剂与仪器 2×Taq PCR Master Mix、DL-2 000、Marker I、细菌基因组DNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品;由中国农业科学院兰州兽医研究所忠新、储岳锋赠送。梯度 PCR仪(T100)，凝胶成像系统(Gel DocXR+)，均购自美国Bio-rad公司。

2 方法

2．1 核酸提取 将鼻拭子标本在生理盐水中反复挤压，吸取上清液用于DNA提取。采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，具体操作步骤按说明书进行，提取的基因组DNA溶于80μL TE溶液中，－20℃ 保存。

2．2 绵羊肺炎支原体的PCR检测 参照文献［5］，合成引物LMF:5'-TGAACGGAATATGTTAGCTT-3'; LMR:5'GACTTCATCCTGCACTCTGT-3'，该引物特异性扩增绵羊肺炎支原体的16S rRNA 361 bp片段。反应体系25μL:模板5μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 5．5μL。反应条件:94℃ 3 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，35 cycles;72℃10 min。取扩增产物5μL进行2%琼脂糖凝胶电泳。以绵羊肺炎支原体标准株Y98的基因组DNA为阳性对照，ddH2O为阴性对照，PCR检测各绵羊群体。

3 结果

3．1 绵羊肺炎支原体的PCR检测 PCR扩增样品中的绵羊肺炎支原体，可获得与预期大小相符的361 bp片段，结果见图1。

图1 绵羊肺炎支原体的PCR检测M1:Marker I;1:Y98 DNA;2～15:nasal swabs DNA;16:Negative control;M2:DL-2 000

3．2 不同绵羊群体肺炎支原体的检出率 从宁夏盐池县、平罗县两地的规模化养殖场采集到滩羊、陶寒杂、杜寒杂和滩寒杂4个绵羊品种的鼻腔拭子403份。绵羊肺炎支原体在各绵羊群体鼻拭子中均有很高的检出率(介于52.0% ～85.7%)，滩羊的检出率最低(52.0%)，滩寒杂最高(85.7%)。从年龄段来看，滩羊在 ＜3个月龄和＞8个月龄两个年龄段检出率为 24.2%和34.4%，3～8月龄为94.3%。其他3个绵羊杂交种的检出率在各年龄段都较高(56.3% ～100.0%)，但均以3～8月龄为最高(87.1% ～100.0%)，结果见表1。

表1 不同绵羊群体肺炎支原体的PCR检测率

4 讨论

绵羊肺炎支原体是引起绵羊和山羊支原体性肺炎的主要病原之一［6-8］。临床上健康羊的上呼吸道也能分离出绵羊肺炎支原体［9］。据张莉等［10］对河北省的6个种羊场绵羊、山羊血清学检测发现，绵羊肺炎支原体的自然病例的阳性检出率为84.2%;冷青文等［11］研究表明，人工圈养盘羊鼻拭子中绵羊肺炎支原体阳性率为29%，野生盘羊的阳性率高达66.7%;黄秀君等［12］研究表明，四川攀枝花地区山羊的绵羊肺炎支原体阳性率为 46.0%;Rong G等［13］对海南山羊血清标本检测结果表明，绵羊肺炎支原体的阳性率为31.7%;Akwuobu C A等［14］对尼日利亚的绵羊和山羊鼻拭子中支原体的检测结果发现，病羊和健康羊只，支原体的分离率分别为16.2%和29.1%，绵羊肺炎支原体在健康羊和有呼吸道症状的羊群中都具有很高的检出率。本项目中，绵羊肺炎支原体在4个绵羊品种中的检出率在52.0%－85.7%(注:待检羊只无明显呼吸道症状)，高的检出率未必意味着高的发病率和死亡率，羊只的高带菌率给该病的防控带来了困难。

绵羊肺炎支原体具有宿主易感性差异。郭晗等［15］研究显示，青海地区绵羊阳性率为30．4%，明显高于山羊(19．7%)，提示绵羊对绵羊肺炎支原体的易感性要高于山羊。黄秀君［12］、沈文等［16］调查表明，盘羊杂交羊在感染支原体后表现出了典型的肺炎症状，而巴什拜羊症状轻微，表现出抗性;陶岳等［17］研究显示，湖羊的发病率是20．4%，死亡率为18．2%，病死率达89．3%，同群细毛羊发病较湖羊少，波尔山羊对本病有一定的抵抗力;冷青文等［18］研究表明，巴什拜羊具有较为丰富的遗传多样性，HaeⅢBC为绵羊肺炎支原体抗性基因，HaeⅢDD为绵羊肺炎支原体的易感基因型;Pst IA和Pst IB、HaeⅢC分别是巴什拜羊绵羊肺炎支原体易感和抗性相关等位基因;何存利等［4］研究发现，宁夏羊场外来品种羊阳性率高于地方品种，1岁以上的羊只阳性率41．2%，明显高于1岁以下羊只的17．4%，区外引进优良品种(母羊以小尾寒羊为主，公羊以陶塞特，萨福克等国外肉羊品种居多)，其抗病能力与本地羊相比明显较弱。本试验中，滩羊绵羊肺炎支原体的检出率为52．0%(其中3月龄以下和＞8月龄的检出率仅有24．2%和34．3%)，明显低于杂交羊的检出率，结合何存利的研究结果，表明滩羊这一地方品种羊对绵羊肺炎支原体具有较高抵抗力，而其抗绵羊肺炎支原体的机制还有待于深入研究。

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The survey of Mycoplasma ovipneumoniae in different sheep breeds in Ningxia area

XIE Xiu-lan1，Eerhehua1，LI Shuai2，MA Xiao-ming1，LI Yu-qiong1，LI Ying-kang1
(1．Institute of Animal Science，Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Yinchuan 750002，China;2．Xinhua College of Ningxia University，Yinchuan 750021，China)

To study the infection rate of Mycoplasma ovipneumoniae in different sheep breeds，403 nasal swabs of4 sheep breeds (Tan sheep，Dorset-Small Tailed Han hybrids，Dubo-Small Tailed Han hybrids and Tan-Small Tailed Han hybrids)were collected from Yanchi and Pingluo counties in Ningxia area，DNA was extracted and gene of Mycoplasma ovipneumoniae was amplified by (PCR)，and positive rates of different sheep breeds and age stages were analyzed．The results showed that positive rates in Tan sheep，Dorset-Small Tailed Han hybrids，Dubo-Small Tailed Han hybrids and Tan-Small Tailed Han hybrids were 52.0%，83.0%，75.5%and 83.0%，respectively．Tan sheep had the lowest positive rate at age stages of under 3 months and older than 8 months，which were 24.2%and 34.4%，respectively．Positive rate at age stages of3 to 8 months was 94.3%;positive rates for all age stages of Dorset-Small Tailed Han hybrids and Tan-Small Tailed Han hybrids were above 74.0%．Positive rate of Dubo-Small Tailed Han hybrids under 3 months was 56.3%，and were above 82.0%at the age stages of more than 3 months．The results suggest that Mycoplasma ovipneumoniae pread in large scale sheep farms in Ningxia region and sheep hybrids was more susceptible to Mycoplasma ovipneumoniae than Tan sheep．

Ningxia area;Tan sheep;Mycoplasma ovipneumoniae;PCR

LI Ying-Kang

S85

A

0529-6005(2017)06-0011-03

2016-05-09

宁夏自然科学基金项目(NZ13127);中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放基金资助(SKLVEB2012KFKT004)

谢秀兰(1980- )，女(回族)，副研究员，硕士，主要从事动物病原分子生物学研究，E-mail:275896605@qq．com

李颖康，E-mail:1377730935@qq．com