天麻钩藤配伍对天麻素和钩藤碱体内药动学的影响

2017-07-31吴丽红侯佳王珏罗曼王丽敏王建新

中国中药杂志 2017年13期

吴丽红+侯佳+王珏+罗曼+王丽敏+王建新+李永吉+秦晶

[摘要] 测定天麻素及钩藤碱体内药动学参数，研究天麻钩藤药对配伍后对天麻素和钩藤碱体内药动学行为的影响。结果天麻钩藤以9∶12配伍后，与二者单味药对照组相比，天麻素和钩藤碱C_max及AUC均显著增加，钩藤t_max后移1.5 h，天麻t_max后移0.25 h，二者由原来相同的达峰时间改变为前后相差1.25 h，说明配伍可显著改变药物体内药动学行为。从整体组方分析，天麻药性缓和滋补，钩藤寒凉苦降，配伍后天麻达峰较快且C_max及AUC增加，先发挥滋阴潜阳作用同时弥补钩藤达峰延后损失的药效；之后，在滋阴的前提下钩藤碱继续达峰且C_max及AUC增加，可弥补天麻半衰期较短的缺点，有利于更好地维持降压作用。二者配伍各自发挥优势互补，避免了单用钩藤苦寒过重累及伤阴，或单用天麻滋补有余，苦寒不足，充分说明钩藤、天麻二者共为君药、标本兼顾的治疗原则具有可靠的药动学依据。该研究通过对天麻钩藤药对配伍后的药动学特征进行研究，发现中医通过天麻、钩藤配伍实现对“肝阳上亢”整体施治目的是具有其药动学基础的，进一步为中医组方用药的科学性、合理性提供药动学依据。

[关键词] 天麻；钩藤；天麻素；钩藤碱；药动学；配伍

[Abstract] To investigate the effect of the combination of gastrodia and uncaria on the pharmacokinetics of gastrodin and rhynchophylline， and determine their pharmacokinetic parameters after administration of the combination of gastrodia and uncaria at the ratio of 12∶9. Compared with uncaria group or gastrodia group， C_max and AUC of both gastrodin and rhynchophylline were significantly increased， and t_max was retroceded by 1.5 h for rhynchophylline and 0.25 h for gastrodin. The change of t_max resulted in a 1.25 h difference in the peak time between gastrodin and rhynchophylline ， which was the same between them. Uncaria shows a more effect in suppressing hyperactive Yang， while gastrodia has a balancing effect by nourishing Yin and suppressing hyperactive Yang. As a result， gastrodia could exert the effect in nourishing Yin and suppressing effect of uncaria， which could avoid the deficiency of Yang affecting Yin due to mono-treatment of uncaria. On one hand， the enhanced AUC and C_max of gastrodin could increase the average plasma drug concentration of gastrodin， and remedy the losing effect of uncaria at the early stage；On the other hand， the increased AUC and C_max of rhynchophylline could make up the quick elimination of gastrodia in vivo at the late stage. Their combination could lead to an increased anti-hypertensive effect with the balance of Yin and Yang. They showed unique advantages compared with simple dosage increase of western medicines. The results were consistent with the principle of TCM treatment for the hypertension due to hyperactivity of the liver Yang. In short， this study gives a good pharmacokinetic explanation of the balance of Yin and Yang and TCM treatment for both symptoms and root cause.

[Key words] gastrodin；uncaria；gastrodin；rhynchophylline；pharmacokinetics；combination

天麻-鉤藤是中医治疗高血压的常用药对[1]，具有平肝熄风之效。现代药理研究表明，天麻中的天麻素、钩藤中的钩藤碱是主要活性成分[2]。有研究报道钩藤碱、天麻素单独用药对血管的舒张作用远不及天麻钩藤饮[3]，二者联合用药后，对血管的舒张作用与天麻钩藤饮类似，说明天麻钩藤在天麻钩藤饮复方中共为君药以及该药对广泛用于治疗高血压的合理性[4]。尽管天麻钩藤药对在高血压治疗中作为方剂配伍的基础应用十分广泛[5-6]，但针对该药对配伍前后的药动学改变研究报道较少。因此本文采用HPLC-MS/MS及HPLC为技术手段，对天麻钩藤配伍前后的药动学进行了研究，旨在探究配伍后的药动学变化的规律，为其临床应用提供科学依据。

1 材料

1.1 试剂天麻素对照品、钩藤碱对照品（南京泽朗医药科技有限公司）；卡马西平对照品、阿昔洛韦对照品（大连美仑生物技术有限公司）；钩藤饮片、天麻饮片（上海德华国药制品有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司），其他试剂为分析纯。

1.2 仪器 AB4000Q TRAP 串联四级杆-线性离子阱质谱仪（Applied Biosystems，美国）；Agilent 1200型高效液相色谱仪（G1312A四元泵，G1316A柱温箱，G1379A在线脱气）；XW-80A型涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；BS224S型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；Elix/Rios高纯水净化器（上海迪发仪器仪表有限公司）；H-1650型离心机（长沙湘仪离心机有限公司）；MD200型氮气吹扫仪（杭州奥盛仪器有限公司）。

1.3 动物清洁级SD大鼠，体重（220±20） g，许可证号SYXK（沪）2010-0099，由复旦大学动物实验中心提供。

2 方法与结果

2.1 对照品及内标溶液配制精密称取钩藤碱对照品适量溶于70%甲醇中，配成质量浓度1.0 g·L^-1的对照品储备液。用70%甲醇梯度稀释得0.1，0.5，2.5，12.5，25.0 mg·L^-1的对照品溶液。精密称取一定量卡马西平（内标）溶于70%甲醇配制成100 mg·L^-1的储备液并稀释为20 mg·L^-1的内标溶液。

精密称取天麻素对照品溶于0.05%甲酸水溶液，配成质量浓度150 mg·L^-1的对照品储备液。0.05%甲酸水溶液梯度稀释得质量浓度为0.15，0.30，1.5，3.0，15 mg·L^-1的对照品溶液。精密称取阿昔洛韦（内标）溶于0.05%甲酸水溶液配制成100 mg·L^-1的储备液并稀释为50.0 mg·L^-1的内标溶液。

2.2 色谱及质谱条件钩藤碱测定色谱条件[7]：色谱柱为Agilent Eclipse Plus C₁₈柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）；流動相A（含1 mmol·L^-1三乙胺的冰醋酸水溶液，pH 7.0）-B（甲醇）30∶70；流速0.8 mL·min^-1；柱温30 ℃；进样量20 μL，记录色谱图，见图1。钩藤碱和内标的保留时间分别为5.33，2.23 min，该色谱条件可较好地将钩藤碱与内源性杂质分离，不影响钩藤碱的测定。

天麻素质谱条件：离子源为电喷雾电离源（ESI）；检测方式为负离子检测；扫描方式为多反应监测（MRM）；喷射电压 4 500 V；离子源温度500 ℃；气帘气流速为10 L·min^-1，碰撞气流速为medium。天麻素及内标阿昔洛韦选择性检测离子分别为m/z 285.1→122.8，224→149.8。

天麻素色谱条件：色谱柱为 Agilent Eorbax SB C₁₈柱（3.0 mm×100 mm，3.5 μm）；流动相A（0.05%甲酸水溶液）-B（乙腈）98∶2；流速 0.2 mL·min^-1；柱温 30 ℃；进样量 20 μL，记录色谱图，见图2。结果天麻素和内标的保留时间分别为5.7，3.9 min，该色谱条件可较好地将天麻素与内源性杂质分离，不影响天麻素的测定。

2.3 血浆样品处理钩藤血浆样品处理：取血浆90 μL，加入20 mg·L^-1的内标卡马西平溶液10 μL，混匀，涡旋振荡1 min，加入400 μL乙腈沉淀蛋白混匀，涡旋振荡3 min，放置冰箱中4 ℃沉淀1 h，取出后12 000 r·min^-1离心15 min，取上清液400 μL，在40 ℃氮气吹干，残余物用流动相溶解，12 000 r·min^-1离心15 min，HPLC进样分析。

天麻素血浆样品处理：取血浆90 μL，加入50 mg·L^-1的内标阿昔洛韦10 μL，混匀，涡旋振荡1 min，加入400 μL甲醇乙腈（1∶4）沉淀蛋白混匀，涡旋振荡3 min，取出后12 000 r·min^-1离心15 min取上清液400 μL，在40 ℃氮气吹干，残余物用流动相溶解，12 000 r·min^-1离心15 min，HPLC进样分析。

2.4 标准曲线绘制取血浆80 μL，加入钩藤碱/天麻素标准溶液10 μL，加入内标卡马西平或内阿昔洛韦溶液10 μL，按2.3项操作，配制成质量浓度为0.005，0.01，0.05，0.25，1.25，2.50 mg·L^-1的钩藤碱标准溶液或配制质量浓度为0.015，0.03，0.150，0.30，1.50 mg·L^-1的天麻素标准溶液，HPLC测定峰面积，以血浆样品中钩藤碱/天麻素浓度为横坐标，钩藤碱/天麻素与内标的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，求得线性回归方程。钩藤碱在0.005～2.5 mg·L^-1线性关系良好，r=0.999 9，回归方程为y=0.331 08x-0.012 69；天麻素在0.015～1.5 mg·L^-1线性关系良好，相关系数r=0.999 8，回归方程为y=0.720 4x-0.046 3。

2.5 方法学考察取钩藤碱质量浓度为0.005，0.05，1.25 mg·L^-1的低、中、高浓度的血浆样品各6份，进行方法学考察。结果日内精密度RSD均小于7.4%；日间精密度RSD均小于6.8%；回收率为97.57%～97.68%。表明钩藤碱体内测定方法符合方法学要求，可用于钩藤碱体内定量检测。

取质量浓度为0.015，0.15，1.50 mg·L^-1的低、中、高浓度的天麻素血浆样品各6份，进行方法学考察。结果天麻素日内精密度小于11%，日间精密度均小于13%，回收率为94.02%～101.1%。基质效应考察结果本方法测定条件下血浆中内源性物质的离子抑制或增强作用可忽略不计，对天麻素的质谱响应没有影响。提示本方法符合方法学要求，可用于天麻素体内定量检测。

2.6 不同配伍比例钩藤天麻水煎液的制备称取天麻饮片9 g，加入450 mL蒸馏水浸泡1 h后煎煮，沸腾30 min后，加入钩藤饮片12 g，合煎15 min，浓缩至生药浓度为6 g·mL^-1的浓缩液。对照组分别为钩藤或天麻单煎浓缩液。

2.7 实验分组及血浆样品采集 18只SD大鼠体重200～250 g，随机分成3组，每组6只。给药前禁食12 h，自由饮水。分组灌胃给予钩藤天麻水煎液、天麻对照水煎液、钩藤对照水煎液。于给药前取空白血浆，给药后0.08，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，10，12 h眼眶静脉丛取血约200 μL，分离血浆备用。

2.8 药时曲线拟合及药动学参数各给药组钩藤碱、天麻素血药浓度-时间数据用 DAS 2.0 药动学程序拟合，组间药动学参数用SPSS 17.0软件分析。各组平均血药浓度-时间拟合曲线见图3，4，药动学参数见表1。

钩藤天麻配伍后，钩藤碱与对照组比较，C_max及AUC均显著增加，t_max明显后移；天麻素与对照组比较，C_max及AUC均显著增加，t_max略有后移。因此，配伍后天麻素及钩藤碱药动学参数均由不同程度的改变，说明天麻钩藤药对配伍应用于高血压的疾病治疗具有其药动学物质基础。

3 讨论

高血压是现代医学的病症名，中医古籍文献中并没有提及该病，但不乏对高血压症状的描述，如眩晕、头痛、中风等。有研究者综合阴阳辩证、虚实辨证及脏腑辨证，归纳总结上千病例认为肝阳上亢、阴虚阳亢、肝肾阴虚及肝风上扰是高血压病的主要证候[8-9]，卫生部于2002年颁布的《中药新药治疗高血压病的临床研究指导原则》也采纳了这一辨证标准[10]。

中医认为肝阳上亢多见于高血压初期，治则平肝潜阳；随着病情进展，阳损及阴，形成肝肾阴虚之证，治则养阴益肾；平肝潜阳属治标，滋阴柔肝属治本。高血压早期多表现为肝肾阴阳失调，故应综合考虑滋肾平肝，育阴潜阳，标本兼治，尽快恢复阴阳动态平衡 [11-12]。

“天麻钩藤饮”出自《杂病证治新义》，天麻、钩藤共为君药，该方平肝熄风、清热活血，常用于肝阳偏亢，肝风上扰证。《高血压中医诊疗指南的推荐意见》（草案）将天麻钩藤饮作为“肝阳上亢”证的首选方剂。天麻、钩藤药对也是现代临床医学文献报道中应用于“肝阳上亢”治疗出现频次最多的药对之一[13]。钩藤，其味甘、微苦，性微寒，归肝、心包经，属寒凉苦降为主的药物，既能清肝热，又能平肝阳，《本草新编》则谓“去风甚速，有风症者必宜用之”；天麻其味甘、辛，性平，归肝经，气性和缓，补肝养胆。因此，钩藤寒凉，药力迅速；天麻滋补，药力和缓。

根据本研究药動学结果分析：天麻、钩藤对照组t_max相同，说明若二者单独应用应同时发挥药效，有助于药效叠加。但我们发现配伍之后，药动学参数不是二者简单加和。首先，钩藤t_max显著后移1.5 h，天麻t_max仅后移0.25 h且同时C_max增加1.6倍AUC增加1.3倍。由此可以看出，给药前期，天麻素通过C_max显著提高来弥补钩藤t_max延后损失的“平肝阳”作用；然后天麻t_max的略微后移提高了其前期整体的血药浓度。由此，具滋补作用的天麻在前期替代钩藤，充分地发挥其“滋阴”、“潜阳”的作用；给药后期，在巩固“滋阴”的前提下，钩藤碱达峰且C_max及AUC显著增加，可弥补天麻半衰期较短的缺点[14]，有助于其更多地发挥苦寒之性“平抑肝阳”。二者的配伍避免了单用钩藤苦寒过重累及伤阴，或单用天麻滋补有余，苦寒不足。

有研究报道了“天麻钩藤饮”的临床药效动力学，结果表明该方效量消退半衰期为1.16 h，效应维持时间为4.82 h，属于起效快，有轻度降压作用的复方[15-16]。这与中医认为该方适用于病情较轻的“肝阳上亢”相吻合。通过本研究从药动学角度分析二者作用时间以及药性的配合，天麻钩藤药对先补后泻、补中有泻，作用有急有缓。中医认为抑阳为治标，滋阴为治本，因此二者共为君药，滋肾柔肝，育阴潜阳，标本兼治，有利于在疾病早期尽快恢复阴阳平衡，说明中医整体施治的思想具有充分的药动学基础。

此外，值得指出的是也有大量的临床研究报道通过调节天麻钩藤的比例、用量或与其他方剂加减配伍来治疗“阴虚阳亢”等证[17-19]。综合本研究结果，不同药物配伍之后可显著改变其体内药动学行为甚至作用强度，可见中医通过对药性的认识总结出的配伍规律具有其科学合理性，在此基础上结合对疾病内在规律的独特认识进行灵活组方、整体施治也是中医的精髓所在。

[参考文献]

[1] 刘卫，王中师，宋书伟，等. 钩藤总碱与天麻素联用对自发性高血压大鼠血压和血压变异性的影响[J]. 中华高血压杂志，2012，20 （6）：570.

[2] 汪江涛，丁伯平. 钩藤碱和异钩藤碱药理作用研究进展[J]. 中国医药导刊，2012，14 （7）：1224.

[3] 刘蓉，卞筱泓，许激扬，等. 中药单体组合的血管舒张作用研究[J]. 华西药学杂志，2011，26 （6）：551.

[4] 李晓倩. 钩藤与天麻配伍前后效应成分大血管分布与基因表达的研究[D]. 成都：西南交通大学，2012.

[5] 郭纯娟. 天麻钩藤饮对肝阳上亢型高血压患者血压影响的临床分析[J]. 中医临床研究， 2013，5 （16）：17.

[6] 蔡昌龙，李明月，邢之华，等. 天麻钩藤饮对肝阳上亢型高血压病患者血浆 SOD、MDA 的影响[J]. 实用医学杂志，2005，21 （3）：321.

[7] 闫瑞，李凌军，李顺. 天钩降压胶囊中钩藤碱大鼠体内药动学研究[J]. 山东中医药大学学报，2014 （3）：257.

[8] 侯文廉. 高血压病的辨证论治[J]. 吉林中医药，1989（3）：15.

[9] 蔡光先，朱克俭，韩育明，等. 高血压病常见证候临床流行病学观察[J]. 中医杂志，1999，40 （8）：492.

[10] 中药新药治疗高血压病的临床研究指导原则（摘编之一）[J]. 中医药临床杂志，2007，19 （2）：118.

[11] 郑文龙，祝光礼. 祝光礼教授治疗高血压的辨证论治思路[J]. 中国中西医结合急救杂志，2015，22 （5）：535.