甲氨蝶呤代谢相关酶基因多态性与大剂量甲氨蝶呤治疗儿童急性淋巴细胞白血病中不良反应的相关性研究

胡 川，徐 刚

甲氨蝶呤代谢相关酶基因多态性与大剂量甲氨蝶呤治疗儿童急性淋巴细胞白血病中不良反应的相关性研究

胡 川，徐 刚*

药物代谢酶的基因多态性可能导致个体甲氨蝶呤疗效及不良反应的不同。尽管近年来化疗方案在不断优化，抗肿瘤药物不良反应仍可能导致化疗不能正常进行，有时甚至危及生命。检测候选基因多态性可增加治疗的安全性，可能有助于指导个体化用药。

基因多态性；甲氨蝶呤；急性淋巴细胞白血病；不良反应

0 引言

急性白血病是儿童最常见的恶性肿瘤之一，其中约80%为急性淋巴细胞白血病(ALL)。近年来,由于联合化疗方案的不断改进、危险度的提前评估、更好的支持及护理，许多发达国家儿童ALL的5年无事件生存率(EFS)已超过85%[1]，其中大剂量甲氨蝶呤(High-dose methotrexate，HDMTX)因其可渗透进血脑、血睾、血眼屏障，在预防髓外白血病的发生中成为重要的治疗方案之一。但其治疗会产生多种药物不良反应，如胃肠道反应、肝肾反应、神经毒性以及骨髓抑制等，影响其在临床的应用。个体基因遗传的差异导致个体对药物疗效及不良反应的不同。本文就甲氨蝶呤(MTX)相关代谢酶基因多态性与急性淋巴细胞白血病应用大剂量MTX药物后不良反应相关性的研究进展进行综述。

1 MTX的作用机制及代谢过程

MTX是一种叶酸拮抗剂，主要作用于细胞分裂的S期。其进入体内主要通过还原叶酸载体-1(RFC1)跨膜进入细胞内，在多聚谷氨酰胺合成酶(FPGS)的作用下转化为一种活性药物形式-多聚谷氨酸(MTXPG)，后者保留在患者的肝脏、骨髓前物质及成纤维细胞中，而MTXPG又能被γ-谷氨酰基水解酶(GGH)水解，导致MTX通过转运体家族(ABC)流出细胞。MTX进入体内主要通过抑制2个酶来干扰叶酸代谢。作为叶酸类似物，其竞争性抑制二氢叶酸还原酶，而二氢叶酸还原酶是二氢叶酸转化为5，10-亚甲基四氢叶酸的关键酶，后者为脱氧尿嘧啶核苷酸(dUTP)转变为脱氧胸腺嘧啶(dTMP)提供甲基，参与DNA的合成。MTX抑制二氢叶酸还原酶活性导致这一过程受阻，使二氢叶酸及其毒性代谢产物多聚谷氨酸盐在细胞内蓄积，同时使还原型叶酸成分减少，造成嘌呤和胸腺嘧啶合成障碍，从而抑制DNA的复制。MTXPG直接抑制胸苷酸合成酶活性，导致dUTP不能转变为dTMP，从而导致DNA合成障碍。

2 MTX代谢相关酶的基因多态性对MTX不良反应的影响

2.1 亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因 MTHFR是叶酸代谢过程中5，10-亚甲基四氢叶酸还原成5-亚甲基四氢叶酸的关键酶，前者是胸腺嘧啶核苷酸合成的重要原料之一，参与DNA的合成与修复;后者是体内主要的甲基供体，参与DNA甲基化，因此，MTHFR对DNA的合成与修复，以及甲基化有重要的调控作用。MTHFR基因位于染色体1p36.3，是目前国内外遗传药理学研究较多的基因之一，其单核苷酸多态性(SNP)突变率较高的位点为C677T(rs1801133)和A1298C(rs1801131)。由于MTX可与叶酸竞争结合MTHFR，MTHFR基因突变导致MTHFR活性的缺陷改变，从而导致血液中5-亚甲基四氢叶酸降低和同型半胱氨酸升高，使得蛋氨酸合成障碍，最终导致DNA甲基化异常，干扰DNA合成和修复，因此，MTX化疗后发生不良反应的风险随之增加[2]。MTHFR C677T突变是指677位密码子胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)置换，从而使编码后的丙氨酸(Ala)变成缬氨酸，导致MTHFR活性下降，对热不稳定性增高，同时其突变可导致MTX化疗后体内同型半胱氨酸水平快速上升，且突变型较野生型同型半胱氨酸水平更高，后者在肝功能损害过程中起一定作用[3]。目前，国内外报道MTHFR C677T基因多态性主要与MTX所致的肝毒性、骨髓抑制及黏膜炎有关。周天媛等[4]对98例儿童ALL的临床研究得出结论：MTHFR基因C677T多态性与ALL患儿HDMTX化疗后的毒副作用有关，主要表现为胃肠道反应(56.12%)和骨髓抑制(36.73%)。杨丽华等[5]对40例ALL患儿的临床研究发现，携有MTHFR突变基因型(CT+TT)患者的48 h MTX血药质量浓度明显高于野生型基因CC者，MTHFR多态性中677CT基因型者肝脏损害发生的风险是CC基因型者的6倍。Hiroko等[6]通过对日本82例ALL及21例非霍奇金淋巴瘤(NHL)的临床研究发现，携带677CT/TT基因型患儿的肝转氨酶更高。MTHFR C1298A突变是指1298位密码子腺嘌呤(A)被胞嘧啶(C)置换，导致谷氨酸被丙氨酸取代。曾有体外实验研究表明，其突变可导致MTHFR活性降低[7]。关于MTHFR C1298A与HDMTX不良反应的相关性研究国内外也有较多报道，土耳其学者Kanta等[8]认为，MTHFR 1298AC/CC基因型48 h血清药物浓度较野生型AA更高，发生骨髓抑制和肝毒性的风险更大。伍艳鹏等[9]研究表明，ALL患儿中，1298AC/CC型较AA型更易发生黏膜损害。郑苗苗等[10]研究发现，MTHFR 1298AC基因型ALL患儿发生血小板减少的风险较AA型提高了13.7倍。不同于上述研究，也有较多学者认为，MTHFR C677T及A1298C基因多态性与HDMTX相关不良反应均无明显相关性，美国学者Aplen等[11]对520例ALL儿童进行了一系列的研究，认为MTHFRC677T和C1298A基因多态性与MTX化疗后不良反应无显著相关性。Lopez-Lopez等[2,12]收集不同种族大量样本后Meta分析得出,MTHFR基因多态性与HDMTX相关不良反应无明显相关性。另外也有学者认为，C677T、A1298C基因突变者MTX相关不良反应的发生风险较野生型减少[13-14]。导致临床试验结果差异的原因，大部分学者认为可能是因为种族之间等位基因频率的差异、基础疾病、叶酸营养状况、饮食或同时服用的药物、MTX剂量、亚叶酸钙解救方案等不同，需要扩大样本量、综合其他代谢酶等进一步前瞻性研究证实。

2.3 二氢叶酸还原酶(DHFR)基因 位于染色体5q11.2～q13.3区域，其编码的二氢叶酸还原酶是二氢叶酸转化为5，10-亚甲基四氢叶酸的关键酶，为MTX作用的主要靶点，MTX进入体内后竞争性抑制二氢叶酸还原酶，导致甲基化及DNA合成异常。目前，报道的DHFR的单核苷酸多态性有C829T、T721A、T216C、A317G等，暂未发现这些SNP与ALL患儿HDMTX不良反应明显相关。

2.4 甲硫氨酸合成酶(MTR)基因和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因 MTR基因位于染色体1q43，编码MTR，后者是细胞内叶酸代谢过程中一种重要酶，可导致5-甲基四氢叶酸的一个甲基断裂形成四氢叶酸，为同型半胱氨酸提供甲基而合成蛋氨酸。目前，MTR基因多态性报道较多的位点为A2756G，其突变导致门冬氨酸被甘氨酸替代而酶活性下降，从而导致同型半胱氨酸水平上升及DNA甲基化下降。MTRR基因位于染色体5p15.3～15.2，其对MTR的辅酶因子维生素B12的甲基化非常重要，MTRR基因多态性可能改变酶活性。目前MTRR基因报道的位点主要为A66G，其突变可导致蛋氨酸突变为异亮氨酸。Huang等[18]对81例ALL患儿大剂量MTX化疗后毒副反应观察得出，MTRR66 AG/GG型相对于野生型更易出现口腔黏膜炎，但其基因多态性是否影响MTRR活性则需要进一步研究。

2.5 叶酸聚谷氨酸合成酶(FPGS)基因和γ-谷氨酰水解酶(GGH)基因 FPGS能够催化进入细胞内的MTX产生MTX多聚谷氨酸(MTXPG)。而细胞内MTXPG的聚集量和链长度是MTX发生细胞毒性作用的主要因素。因此，FPGS基因多态性很可能与患者MTX毒副反应有相关性。目前报道的FPGS基因多态性的位点主要包括rs10760502G>A、FPGS 1901C>T、FPGS 1994A>G、FPGS rs1544105C>T等，暂未发现其多态性与MTX毒副反应相关。刘曙光等[19-20]先后对rs10760502G>A及rs1544105C>T进行研究，均未发现其多态性与MTX毒副作用具有相关性。γ-GGH重要的功能是将MTXPG水解为原型MTX，其与FPGS动态平衡影响MTX在体内的处置，其基因突变可能导致氨基酸序列改变，影响酶的功能。目前报道较多的基因位点为401C>T(rs3758149)，泰国学者曾对105例ALL患儿大剂量MTX治疗后的毒副反应进行临床观察，发现401CT/TT型较野生CC型发生白细胞减少及血小板减少的风险高[21]。

3 甲氨蝶呤转运体的基因多态性对甲氨蝶呤不良反应的影响

3.1 还原叶酸载体1(RFC1/SLC19A1)基因 位于染色体21q 22.2～22.3区域,G80A为RFC1基因常见的多态性位点。在RFC1第80位点(rs1051266)G→A，导致精氨酸被组氨酸替代而蛋白质结构改变，可能导致转运蛋白对叶酸或MTX的亲和力下降，从而导致叶酸或MTX跨膜转运减少。加拿大学者对204例急性淋巴细胞白血病患儿研究发现，RFC80AA型MTX血清药物浓度较高[22]。Dayse等[23]也同意此观点，认为80AA型患儿血清中MTX水平较80GG型下降缓慢，从而导致MTX不良反应较高。近年国内也有报道，与RFC1野生基因型患儿相比，RFC1 80AA/AG基因型44 h血清药物浓度较高[24]。对于RFC1基因多态性与MTX不良反应的关系国内外观点各异。Gregers等[25]对瑞典500例ALL患儿进行了一系列的研究，认为AA型发生血小板减少及血红蛋白下降的风险高于GG/GA型，二者之间差异有统计学意义(P=0.004)，GG型发生肝功能异常的风险增加。日本学者Imanishi等[26]则认为，AA型发生肝功能的异常风险更高，GG型呕吐不良反应的可能性更大。但近年我国学者陆爱东等[27]对108例ALL患儿进行一系列临床研究得出，RFC1 G80A基因多态性与MTX不良反应发生率及血浆浓度均无明显相关性，认为导致研究结果不尽相同的原因可能为：①RFC1可能不是独立影响因子，MTX在体内的代谢受多个基因的调控，每个基因在代谢过程中所起作用的重要性尚不清楚，而RFC1可能不是关键的影响因子。②不同研究中MTX用量不同，小剂量MTX治疗时主要靠RFC1转运进入细胞，HDMTX治疗时也有一部分MTX靠渗透进入细胞，因此，不同剂量的MTX可能造成不同的结果。

3.2 SLCO1B1 位于染色体12p12.2，是有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1)的编码基因。OATP1B1是体内主要的摄取转运体之一，可介导MTX从血液向肝细胞的跨膜转运。SLCO1B1具有高度遗传多态性，某些基因变异可影响OATP1B1的转运能力。目前研究较多的位点主要为：rs11045879、rs4149081、rs4149056及rs2306283等。2009年美国一项SLCO1B1全基因组研究发现，rs4149081及rs11045879与MTX排泄密切相关，野生型MTX清除率明显高于突变型，而增加MTX清除率的基因型也会显著增加MTX的胃肠道反应，rs11045879野生型(TT)和rs4149081野生型(GG)胃肠道反应相对危险性分别为16.4和15.3，显著高于突变型[28]。随后西班牙Lopez-Lopez等[29]及我国李军等[30]的前瞻性临床试验表明，rs4149081AA型及rs11045879CC型较其他基因型血清MTX浓度更高，发生肝功能损伤、骨髓移植等全身不良反应的风险显著增高，认为MTX相关全身毒性和肾毒性随血药浓度的增加而增大，而腹泻和黏膜炎与血药浓度无关。Ramsey等[31]一项纳入1 279例ALL患儿的多中心研究发现，rs4149056的每一个C等位基因会使MTX的平均清除率减少12 mL/(min·m2)，CC基因型患者体内MTX的平均清除率比TT型低13%左右，rs2306283含有A基因型者MTX清除率更低，这样的差值可能对MTX的疗效和药物不良反应产生显著的影响。

3.3 ABC转运蛋白超家族 即ATP结合盒式蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC)，是古老而庞大的家族，是一类ATP驱动泵，由2个跨膜结构域及两个细胞质ATP结合域组成。ABC转运蛋白超家族可分为8个亚家族(ABCA-ABCG)，国外早有研究表明，ABCB1、ABCC1-4和ABCG2在MTX流出细胞中起到重要作用[32]。目前研究较多的基因是ABCB1亚族，其位于染色体7q21.1，编码P-糖蛋白。后者可通过其疏水性位点与疏水性抗肿瘤药物结合，通过ATP水解提供能量，以主动转运的方式把药物泵至细胞外。ABCB1基因研究较多的位点为3435位点(rs1045642)，有研究发现，当ABCB1基因3435位点为CC型时，P-糖蛋白在肠道为高表达状态，增加药物排泄，使体内血药浓度降低；而为CT/TT型时，P-糖蛋白表达明显下降，且表达的蛋白结构不完整，影响蛋白功能发挥，药物容易在体内蓄积，药物不良反应增加[33]。陆爱东等[27]对108例ALL患儿进行临床研究得出了类似的结论：ABCB1 C3435T突变型的24 h MTX血浆浓度高于野生型，且前者具有更高的肝功能损伤发生率，差异均有统计学意义。Zqheib等[34]对127例黎巴嫩ALL患儿的临床研究发现，ABCB1 C3435T(rs1045642)和C1236T(rs1128503)变异基因携带者与中性粒细胞减少密切相关。Lopez-Lopez等[35]通过151例西班牙ALL患儿对其他亚族进行了相关研究，认为ABCC2(rs3740065)及ABCC4(rs9516519)多态性可显著影响MTX血清药物浓度，二者可作为MTX不良反应的预测指标。此外，ABC家族还有很多基因多态性的报道，如ABCG2 C421A、ABCC1、ABCC3等，暂未发现这些基因多态性有与MTX不良反应明显相关的报道。

总之，MTX代谢极其复杂，其过程有多种酶参与，且每个酶的基因多态性对MTX不良反应的影响不同，因此需要对这些代谢酶的作用及其基因多态性有更加深入的认识，且需综合考虑，这样有助于指导临床大剂量MTX方案化疗的个体化实施，减少药物相关不良反应的发生，让患儿最大程度受益。

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Gene polymorphisms of methotrexate-metabolizing enzymes-related genes:its association with adverse effects of high-dose methotrexate in childhood acute lymphoblastic leukemia

HU Chuan,XU Gang*

(Department of Pediatric Hematology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Gene polymorphism in drug-metabolizing enzymes may cause individual differences in the effectiveness and toxicity of methotrexate.Although the chemotherapy regimens for childhood acute lymphoblastic leukemia have been improved in recent years,many adverse effects resulting from anti-cancer drugs may cause the interruption of chemotherapy.Some severe ones are even life-threatening.Determining the polymorphisms of selected genes may increase the safety of the chemotherapy,and may help develop individualized therapies.

Gene polymorphism;Methotrexate;Acute lymphoblastic leukemia;Adverse effects

2016-11-15

中国医科大学附属盛京医院小儿血液内科，沈阳 110004

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201707029