聚合水稻温敏核不育基因和反温敏核不育基因创制永久核 不育系

江建华 倪金龙 吴爽 王德正



聚合水稻温敏核不育基因和反温敏核不育基因创制永久核 不育系

江建华 倪金龙 吴爽 王德正*

(安徽省农业科学院 水稻研究所/国家水稻改良中心合肥分中心/安徽省水稻遗传育种重点实验室，合肥230031；*通讯联系人，E-mail：wdzhengqin@163.com)

【目的】制种安全是影响两系杂交稻持续健康发展的关键问题。本研究旨在探索解决两系杂交水稻的制种安全隐患途径。【方法】以16个（光）温敏核不育系与4个反温敏核不育系配组并对F1育性进行观察，选择矮紫S（温敏核不育系）和矮雁s（反温敏核不育系）为构建永久核不育系的供源亲本。通过回交将矮紫S和矮雁s的育性基因导入到桥梁亲本天丰B中，分别育成天丰B的近等基因系天丰S和天丰s。【结果】天丰S和天丰s杂交获得的天丰Ss即为永久核不育系。对天丰Ss的育性、可恢性等特性的研究表明，天丰Ss在自然长日高温和短日低温下均表现不育；天丰Ss及其3个亲本与5个恢复系杂交的F1组合结实率无明显差异。【结论】永久核不育系的创制有望从根本上解决两系杂交水稻的制种安全问题。

水稻；温敏核不育；反温敏核不育; 永久核不育系

两系法杂种优势的利用不受恢保关系限制，配组自由，与三系法相比能更广泛地利用水稻种质资源中存在的杂种优势[1-2]。近40年来，随着研究的深入和种子生产技术的完善，高产优质多抗组合不断育成并得到大面积推广，为我国的粮食安全做出了重要贡献[3]。虽然目前两系杂交水稻育种技术亦趋于成熟[4-5]。但是，频繁发生的两系杂交稻大面积制种失败事件，已成为影响国家粮食安全和社会稳定的隐患[6-7]。如何有效解决两系杂交稻制种安全问题已成为摆在我国水稻育种家及研究者面前的重要课题。为此，研究者提出了诸多解决方案，主要可以概括为以下三点：一是降低水稻两用核不育系不育起点温度以及延长其耐低温时间[7]；二是注重两系制种基地和时段的选择[8]；三是严格控制水稻两用核不育系不育起点温度的漂变[9]。以上方案能在一定程度上降低制种风险，然而并不能从根本上解决问题。

目前报道的水稻两用核不育系主要可以分为光温敏（长日高温不育型）、温敏（高温不育型）、反光温敏（短日低温不育型）和反温敏（低温不育型）4种类型[6-7,10]。但当前生产上大面积应用的均为温敏或光温互作类型，对于反（光）温敏核不育系的研究很少。自1991年李训贞等[11]对反温敏核不育系N-10s和N-13s的育性鉴定以来，目前仅有几篇关于反温敏核不育系研究的报道，且主要集中于反温敏核不育系本身对温、光反应特性的研究[12-13]，尚未见反（光）温敏核不育系育种利用的报道。梁满中等[14]以反温敏核不育系go543S与光温敏核不育系农垦58S、7001S、培矮64S和长选3S配制杂交F1，发现这4个组合的F1在自然长日高温、短日低温和不同人工光、温处理条件下花粉均表现不育，自交结实率为0，并未出现像go543S或农垦58S那样的育性转换现象。本课题组多年来一直从事两系杂交水稻的育种研究工作[15-16]，受梁满中等[14]反温敏核不育系与光温敏核不育系杂交F1不育的启发，本研究利用桥梁亲本构建了温敏核不育和反温敏核不育的近等基因系，通过对近等基因系杂交F1的育性、可恢性、产量竞争优势及繁殖特性进行系统研究，以期为解决两系杂交水稻的制种安全问题提供些许参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料包括20个不育系，其中籼型温敏核不育系9个，粳型光温敏核不育系7个，籼型反温敏核不育系3个以及粳型反温敏核不育系1个；恢复系5个和桥梁亲本1个。详细信息见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 永久核不育系供源亲本的筛选

2008年夏在安徽庐江基地、2009年春在海南陵水基地利用9个籼型温敏核不育系与3个籼型反温敏核不育系以及7个粳型光温敏核不育系和1个粳型反温敏核不育系进行正反交两两配组，共配制了68个组合。2009年夏将配制成功的59个F1组合及其亲本种植于庐江基地，5月8日播种，6月7日移栽。各材料种植3行，每行9株，株行距16.7 cm×26.7 cm。以各组合中50%的植株幼穗中部露出剑叶叶鞘时记为该组合的抽穗期；于抽穗20 d后调查各F1组合中间5株的总有效穗数、总粒数和总实粒数，计算单穗总粒数、单穗实粒数以及结实率；对于不结实的杂交组合割茬再生，并调查再生植株抽穗15 d后的单穗总粒数、单穗实粒数和结实率，方法同上。

1.2.2 永久核不育系直接亲本的选育

以优质、多抗、综合性状优良的骨干亲本三系保持系天丰B为桥梁亲本，分别利用筛选到的供源亲本矮紫S和矮雁s与其杂交、自交以及回交，直至获得除育性外，其余性状与天丰B基本一致的温敏核不育系（天丰S）和反温敏核不育系（天丰s），选育过程如图1。

1.2.3 永久核不育系育性调查

2015年4月30日起将永久核不育系天丰Ss、直接亲本天丰S、天丰s以及供源亲本矮紫S分8期播种于庐江基地，每10 d一期，25 d后移栽。自始穗期开始，每隔2~4 d各材料分别取5穗，每穗取上、中、下3个部位已成熟但尚未开花的花药1个，用1%的碘-碘化钾溶液染色，镜检3个视野中的花粉染色情况，统计不同播期各材料的花粉败育率，直至抽穗结束；同时每次镜检时各材料均选5个已抽穗但尚未开花的穗套自交袋并标注日期，成熟后考查单穗总粒数和实粒数，计算自交结实率。

1.2.4 永久核不育系的可恢性、产量竞争优势及繁殖特性调查

可恢性和产量竞争优势的测定：2016年春在海南陵水以永久核不育系及其3个亲本为母本与5个籼稻恢复系按×模式配制20个杂交组合；2016年正季将上述所配组合及其亲本种植于安徽庐江基地，5月10日播种，6月10日移栽。单本种植，各材料均种植3行，每行9株，株行距16.7 cm×26.7 cm。3次重复，随机区组排列，常规栽培管理。成熟时，各小区取第2行中间5株调查单株有穗数、总粒数和实粒数，晒干脱粒扬净后称重，计算单株总粒数、单株实粒数、结实率和单株产量；从各重复中随机取出饱满稻谷1000粒称重，3次重复的均值即为该材料（组合）的千粒重。

繁殖特性调查：2016年7月10日将天丰S和天丰s播种于庐江基地，7月29日移栽，株行距13.3 cm×13.3 cm，父母本间距26.7 cm，天丰S与天丰s行数比为10∶2，栽插面积0.09 hm2，父母本开花期喷施赤霉素调节株高，并辅以人工赶粉，成熟时收种，晒干扬净称重。

2 结果与分析

2.1 永久核不育系供源亲本的筛选

7个粳型光温敏核不育系与1个粳型反温敏核不育系成对正反交配制了14个F1组合，同一组合正反交抽穗期基本一致。其中，粳518S/粳5278s F1正反交组合8月2日抽穗，粳519S/粳5278s F1正反交组合抽穗期分别为8月9日和11日，其余10个粳型正反交组合的抽穗期介于8月24－28日。

由表2可知，14个粳型F1正反交组合的结实率为68.99%~88.26%，表现正常可育。说明反温敏核不育系粳5278s可以恢复本研究所用的7个粳型核不育系的育性，反之亦然。

籼型温敏核不育系2301S、广茉S、广占63S和新二S与3个籼型反温敏核不育系所配24个正反交组合的抽穗期介于8月11－23日；24个正反交组合结实率为65.71%~86.52%，表现正常结实(表2)。说明上述4个温敏核不育系可以恢复这3个籼型反温敏核不育系的育性，这3个籼型反温敏核不育系也可以恢复以上4个籼型温敏核不育系的育性。

表1 试验材料

图1 利用天丰B为桥梁亲本选育正反温敏核不育近等基因系天丰S和天丰s

Fig. 1. Breeding procedures of near iso-genic lines Tianfeng S with thermos-sensitive genic male and Tianfeng s with reverse thermos-sensitive genic male by using bridge parent of Tianfeng B.

1892S、P88S、矮占43S、矮紫S和培矮64S与3个籼型反温敏核不育系所配21个正反交组合的抽穗期介于8月21－28日，所有21个正反交组合的自交结实率均低于1.24%，表现不育（表2）。将上述21个组合的F1植株割茬再生，再生植株抽穗期为9月25日至10月5日，各组合再生植株抽穗15 d后的低温自交结实率均为0，表现彻底不育。其中，P88S/雁农s、矮紫S/雁农s和矮紫S/矮雁s 3个正反交组合不同时期均彻底败育，是创制永久核不育系供源亲本的理想材料。结合表2不同组合每穗总粒数来看，矮紫S/矮雁s正反交组合的每穗总粒数多于P88S/雁农s和矮紫S/雁农s组合，且矮紫S和矮雁s均是本课题组自行选育、含有新型矮秆基因的2个核不育材料。基于此，本研究将矮紫S和矮雁s作为创制永久核不育系的供源亲本。

2.2 永久核不育系的育性观察

利用供源亲本矮紫S和矮雁s分别与桥梁亲本杂交并不断回交，获得除育性外其余性状与天丰B一致的2个近等基因系天丰S（温敏核不育系）和天丰s（反温敏核不育系）。2015年春将天丰S和天丰s种植于海南陵水基地并杂交，获得天丰S与天丰s的F1（天丰Ss），天丰Ss即为创制的永久核不育系。2015年夏将天丰Ss及其3个亲本（矮紫S、天丰S和天丰s）种植于安徽庐江基地以观察其育性。由表3可知，4个不育系花粉败育率与套袋自交结实率结果一致。3种类型的不育系在不同温度条件下，育性表现不同。温敏核不育系矮紫S和天丰S长日高温表现不育，其中供源亲本矮紫S不育期从8月1日持续至9月9日，花粉败育率达99.94%，套袋自交结实率不超过0.38%；而利用矮紫S选育的温敏核不育系天丰S的不育期更长，从7月27日一直持续至9月12日，花粉败育率高于99.61%，套袋自交结实率小于0.36%。可见，创制永久核不育系的直接亲本天丰S比供源亲本矮紫S的不育性更好。

反温敏核不育系天丰s在8月1日至9月9日间花粉败育率为0.33%~78.56%，套袋自交结实率在6.78%~86.54%，说明天丰s长日高温下表现可育。

永久核不育系天丰Ss从始穗期（7月25日）至调查结束（9月19日），其花粉败育率均达到99.51%以上，套袋自交结实率更是低于0.20%，说明永久核不育系天丰Ss无论是长日高温还是短日低温下均表现不育。

2.3 永久核不育系天丰Ss的可恢性及产量竞争优势的测定

永久核不育系天丰Ss及其3个亲本与扬稻6号等5个籼稻恢复系测配，成熟期调查所配组合的结实率及产量相关性状。由表4可知，20个组合的结实率为69.8%~86.7%，其中利用永久核不育系天丰Ss所配5个组合的结实率更是高达82.6%，说明天丰Ss的育性可恢复。从另外4个产量相关性状来看，除千粒重外，利用永久核不育系的3个亲本所配15个组合的单株有效穗数、每穗总粒数和单株产量中分别有14个、10个和12个，小于利用天丰Ss所配相应组合。由上可知，本研究创制的永久核不育系天丰Ss的育性是可恢的，且其所配组合具有一定的产量竞争优势。

2.4 永久核不育系天丰Ss的繁殖特性

温敏核不育系天丰S和反温敏核不育系天丰s是创制永久核不育系天丰Ss的直接亲本。天丰S和天丰s在相同温度条件下，育性表现相反。因此，永久核不育系天丰Ss的繁殖较当前生产上应用的温敏核不育系如矮紫S等更加容易。如既能以天丰S为母本、天丰s为父本进行高温夏繁繁殖天丰Ss，也能以天丰s为母本、天丰S为父本进行低温秋繁或海南冬繁繁殖天丰Ss。2016年夏在安徽庐江基地以天丰S为母本，天丰s为父本制种0.09 hm2，收获天丰Ss种子97.5 kg，平均1083 kg/hm2。产量较低可能与抽穗扬花期遇到长时间异常高温导致父本天丰s花粉活力不足、异交结实率较低有关。

表2 水稻温敏核不育系与反温敏核不育系正反交F1每穗粒数和结实率的调查

温敏核不育系(♀)×反温敏核不育系(♂)为正交，反之为反交。

Forward hybridization, thermo-sensitive genic male sterile line (female) × reverse thermo-sensitive genic male sterile line (male), on the contrary, reverse hybridization. SNP, No. of spikelets per panicle; FGP, No. of filled grains per panicle; SSR, Seed-setting rate.

表3 永久核不育系天丰Ss及其3个亲本自然条件下的育性表现

3 讨论

本研究利用7个粳型温敏核不育系与1个粳型反温敏核不育系以及9个籼型温敏核不育系与3个籼型反温敏核不育系杂交配制了59个正反交F1组合。其中，所有14个粳型F1正反交组合以及2301S等4个籼型温敏核不育系与3个籼型反温敏核不育系所配的24个F1正反交组合的结实率为65.71%~88.26%，表现正常可育，说明上述所用的（光）温敏核不育系中的不育基因与反温敏核不育系中的不育基因聚合可以相互恢复育性。而1892S等另外5个籼型温敏核不育系与矮雁s等3个籼型反温敏核不育系所配21个正反交组合的自交结实率不超过1.24%，且这些组合的再生植株自交结实率为0，表现不育，这与梁满中等[14]研究结果一致。通过系谱分析发现，9个籼型温敏核不育系中，除2301S和新二S的育性基因（可能）来源于安农S-1外，其余7个温敏核不育系的育性基因均来源于农垦58S。说明安农S-1的育性基因与雁农s的育性基因可以相互恢复育性；但来源于农垦58S的育性基因与来自雁农s的育性基因聚合却出现可育与不育两种类型，如广茉S和广占63S与雁农s等配组子代是可育的，而1892S、矮紫S、矮占43S、P88S和培矮64S与雁农s等配组则出现永久不育的现象。说明农垦58S可能含有2个以上的育性基因，从而导致其衍生后代含有不同的育性基因，即广茉S、广占63S与1892S等分别含有农垦58S中不同的育性基因。这需要我们进一步从分子层面上对温敏和反温敏核不育系的育性遗传机理及两者之间的作用方式进行遗传解析。

表4 永久核不育系天丰Ss及其3个亲本与5个籼稻恢复系配组F1产量相关性状的表现

本研究将温敏核不育系矮紫S和反温敏核不育系矮雁s中的育性基因导入到桥梁亲本天丰B中，育成分别只含有矮紫S和矮雁s育性基因而其他性状均与天丰B一致的近等基因系天丰S和天丰s。天丰S与天丰s杂交子代天丰Ss无论是长日高温还是短日低温均表现不育，且天丰Ss与籼稻恢复系所配组合结实率正常并表现出一定的产量竞争优势。因此，生产上利用永久核不育系天丰Ss进行两系杂交稻制种时将不会出现由于温度的异常变化而导致的“打摆子”现象，为解决当前两系杂交稻制种安全问题提供了一条新的思路。但是，本研究大部分内容均是通过试验设计进行的理论上的研究，生产上无论是永久核不育系天丰Ss的繁殖还是利用天丰Ss进行制种之前，不仅要明确创制永久核不育系的2个直接亲本（天丰S和天丰s）的育性转换临界温度以及天丰S、天丰s和天丰Ss的特征特性，特别是与制种产量紧密相关的开花习性，同时还要进行不同生态环境中的小规模制种试验，为永久核不育系生产上大规模的应用与推广奠定基础。

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Development of Permanent Genic Male Sterile Line by Pyramiding Thermo-sensitive Genic Male Sterile Genes and Reverse Temperature Induced Genic Male Sterile Genes in Rice (L.)

JIANG Jianhua, NI Jinlong, WU Shuang, WANG Dezheng*

(Institute of Rice ResearchAnhui Academy of Agricultural SciencesHefei Sub-center of China National Rice Improvement CenterAnhui Key Laboratory of Rice Genetics and BreedingHefei 230031China*Corresponding authorE-mailwdzhengqin@163.com)

【Objective】The security problem of seed production has seriously hampered the steadily and sustainable development of two-line hybrid rice. 【Method】Aizi S (thermos-sensitive genic male sterile, TSGMS) and Aiyan s (reverse temperature sensitive genic male sterile line, RTSGMS) were screened as the original parents to develop permanent genic sterile line (PGSL) according to the F1fertility of crosses among 16 (light-) TSGMS and 4 RTSGMS.The fertility genes were introduced into the near isogenic lines Tianfeng S and Tianfengs by backcrossing Aizi S and Aiyan s with the bridge parent Tianfeng B, respectively.Then, Tianfeng Ss, the PGSL, was observed from the cross between Tianfeng S and Tianfeng s. The fertility, restoration, competitive advantage of yield-related traits and reproductive characteristics of Tianfeng Ss were investigated. 【Result】Tianfeng Ss was completely sterile undernatural long day with high temperature and short day with low temperature.And no obvious difference was noted among the F1crosses from Tianfeng Ss and its three parents and five restorers in spikelet fertility percentage. 【Conclusion】The results showed that the newly developed PGSL might solve the security problem of seed production in two-line hybrid rice fundamentally.

rice; thermo-sensitive genic male; reverse thermo-sensitive genic male; permanent genic sterile line

10.16819/j.1001-7216.2017.7017

Q786; S511.0351

A

1001-7216(2017)04-0371-08

2017-02-14;

安徽省科技计划资助项目(1501031096)；国家重点研发计划资助项目(2016YFD0101105)。

修改稿收到日期：2017-03-30。