超级早稻中早39稻瘟病抗性的系谱分析

梁燕 季芝娟 曾宇翔 张翠真 吴晗霖 杨长登，*



超级早稻中早39稻瘟病抗性的系谱分析

梁燕1季芝娟1曾宇翔1张翠真2吴晗霖1杨长登1，*

(1中国水稻研究所/水稻生物学国家重点实验室，杭州310006；2长江大学生命科学学院，湖北荆州434023；*通讯联系人，E-mail：yangchangdeng@126.com)

【目的】研究常规超级早籼稻品种中早39持久高抗稻瘟病的遗传基础，【方法】利用田间抗性鉴定、稻瘟病抗性基因分子标记检测和基因测序的方法，分析中早39稻瘟病持久抗性的遗传基础。【结果】中早39、金早47和中组3号对7个稻瘟病抗性基因和的分子标记均呈阳性条带；且中早39与金早47、中组3号对5个稻瘟病生理小种的抗性表现完全相同。中早39与金早47、中组3号无论是表型还是基因型都完全一致；序列分析结果表明中早39系谱中的供试材料均含有抗病等位基因。【结论】中早39的抗稻瘟病特性经中组3号，来源于金早47。含有的地谷与中早39、金早47和中组3号对5个稻瘟病生理小种的表型相同。

分子标记；抗性基因；基因测序；系谱分析

近年来，随着社会发展，农业种植结构的进一步调整，我国的粮食安全隐忧突出[1]。常规早籼稻因其耐储存、用途广泛、商品性好等特点，特别是作为工业用粮的作用大大增加，是我国粮食安全的重要支撑。2013年中早39被农业部确定为超级稻品种，因其具有高产优质和持久抗稻瘟病的特点，连续6年(2011－2016)被农业部推荐为超级稻示范推广品种[2]，最近几年一直作为浙江省早稻区试的对照材料。2008－2009年浙江省早稻区域试验中，中早39的稻瘟病抗性为抗或高抗。2013年中早39连创两项浙江农业水稻高产纪录，成为浙江省早稻种植面积最大的品种[3]。中早39作为恢复系广泛应用于早稻育种中，由中早39配制的两系杂交籼稻组合株两优39也于2014年通过了国家审定。

前期研究中我们采用来自全国12个省市的 146个菌株对中早39进行了稻瘟病抗谱测定，结果表明中早39对籼型小种的平均抗谱为82.9%，对粳型小种的平均抗谱为71.2%。中早39对不同省市的稻瘟病菌株的抗谱不一致，对浙江、贵州和广西的菌株抗谱分别为92.9%、93.1%和100%，说明中早39在这3个省份可以作为稻瘟病抗性育种的抗源使用[4, 5]。中早39是由中组3号和嘉育253杂交选育而成[6]，中组3号由金早47经无性系变异选育而成；早籼稻品种金早47是金华市农业科学研究所用中87-425/陆青早1号作亲本选育而成[6](图1)，田间表现高抗稻瘟病。追溯中早39的系谱并结合各品种的田间抗性表现，推测中早39对稻瘟病的抗性是经由中组3号来自金早47，但是缺乏理论依据。

聚集抗病基因是抗性育种的主要方法。鉴定、定位和克隆广谱抗稻瘟病基因，对深入理解水稻广谱抗病的分子机制，培育广谱和持久抗病品种，持续有效控制稻瘟病具有重要意义[7]。前期研究结果表明，中早39广谱持久抗性的基础是含有抗性等位基因、和。和是水稻叶瘟抗性位点上的5个抗性等位基因中的两个，其中来自小粒野生稻，抗谱广；来自水稻品种BL1，对日本大多数稻瘟病菌小种有抗性，对中国的菌株ZB13和ZC15也表现抗病反应。源自Q61的稻瘟病抗性基因，对中国菌株CHL39有较强的叶瘟抗性，Pi36的第590个氨基酸由丝氨酸取代天冬氨酸；来源于粳稻羊毛谷，对籼稻小种表现广谱高抗；源自籼稻品种地谷的主效抗稻瘟病基因，对我国稻瘟病生理小种ZB15表现较高的叶瘟抗性[6]。是单拷贝基因，编码长度为825个氨基酸的跨膜受体蛋白激酶(RLK)，该激酶氨基端含有疏水性信号肽、β-lectin结构域、PAN域和TM域，羧基端是个典型的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域(STK)。因含有膜外β-lectin结构属于新的抗病基因类型，其抗感差异是抗病蛋白的第441氨基酸由异亮氨酸(I)突变为感病蛋白的甲硫氨酸(M)造成的[6,8]；同样源自籼稻地谷的主效抗稻瘟病基因，对我国稻瘟病生理小种Zhong-10-8-14表现较高的抗性水平[6,9]。因此，我们利用这7个抗性基因，研究中早39的系谱。

本研究利用田间接种鉴定、分子标记鉴定、抗性基因测序、生物信息学分析等方法，明确中早39中的抗稻瘟病的基因及其来源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

中早39、嘉育253、中组3号、金早47、丽江新团黑谷、原丰早、CO39、地谷和稻瘟病鉴别品种(特特普、珍龙13、四丰43、东农363、关东51、合江18和丽江新团黑谷)，以及研究中用到的稻瘟病菌株均由中国水稻研究所水稻生物学国家重点实验室育种新技术课题组提供。浙辐802、嘉育293、湘早籼1号、青谷矮3号和陆青早1号为中国水稻研究所水稻种质资源库魏兴华研究员提供, 系谱见图1。其中丽江新团黑谷、原丰早和CO39作为稻瘟病鉴定的感病对照品种。

1.2 分子检测

参照Warude等[10]的方法提取水稻全基因组DNA，1%琼脂糖胶电泳和超微量分光光度计(Thermo Scientific NanoDrop 2000c, 美国)检测其产量和质量。25 μL PCR体系和反应条件参照Liang等[7]，每对引物的退火温度参照表1。用3%琼脂糖凝胶(含GelRed)电泳分离后，于BIORAD凝胶成像仪下拍照。PCR产物送铂尚生物技术(上海)有限公司测序，每个PCR独立扩增，重复测序至少3次。

图1 超级早稻中早39系谱

Fig. 1. The genealogy of super early rice Zhongzao 39.

DNA序列经BioEdit软件人工校对和序列拼接。利用在线软件“GeneScan (http://genes.mit.187edu/ genscan.html)和Fegenesh (http://linux1. softberry. com/berry. phtml? 188 Topic = fgenesh&group = programs & subgroup = gfind)”进行编码区预测。利用在线软件MultAli(http: //multalin.toulouse.inra.fr/ multalin)进行序列比对[11]。

1.3 接种鉴定

抗病表型鉴定所用的稻瘟病菌株分别采自浙江省(14-754、10-105、12-157、16-754)和江西省(16-161)早籼稻主产区重发病区的稻瘟病病穗。在稻瘟病鉴别品种特特普、珍龙13、四丰43、东农363、关东51、合江18和丽江新团黑谷上鉴定上述5个稻瘟病生理小种的致病类型，除了来自江西省的16-161属于ZG类群外，其他4个菌株均属于ZA和ZB类群(表2)。在中国水稻研究所实验基地进行分生孢子分离、培养和接种。分生孢子接种浓度为2×105~5×105个/mL，添加0.2% 吐温-20，在水稻分蘖盛期注射接种。一周后调查发病情况，依据国家农业行业标准(水稻稻瘟病鉴定技术规范)记载病情，以发病最重的稻株作为该品种的抗性级别，每个重复中只要有2 株以上感病即记为感(S)，低于2株记为抗(R)。

2 结果与分析

2.1 表型鉴定

中早39由中组3号和嘉育253杂交选育而来，而中组3号是金早47经无性系变异选育而成，田间表现具有与金早47一致的稻瘟病抗谱。供试材料接种于2016年8月3日，一周后的田间接种鉴定结果显示(表3)，稻瘟病生理小种14-754侵染金早47、中组3号和中早39，而其他4个小种10-105、12-157、16-754和16-161则不能侵染这3个品种。金早47、中组3号和中早39对实验中的5个生理小种的抗谱一致。系谱分析结果表明，稻瘟病生理小种14-754对系谱上游的浙辐802、嘉育293、湘早籼1号、青谷矮3号和陆青早1号表现免疫，从金早47开始致病，在中组3号和中早39发病。作为中早39亲本之一的嘉育253除了对14-754表现感病外，对16-754也表现感病，说明中早39的抗稻瘟病特性源于中组3号和金早47。地谷对这5个菌株的抗病反应与金早47、中组3号和中早39完全一致(表3)。

表1 稻瘟病抗性基因检测和序列分析所用到的引物

“*”用于基因测序的引物。

“*” indicates the primers for gene sequencing.

表2 鉴别品种对供试稻瘟病菌株的抗性表现

表3 供试材料的稻瘟病田间抗性表现

2.2 分子标记检测

如图2所示，稻瘟病抗性基因的分子标记在浙辐802、青谷矮3号、陆青早1号、金早47、中组3号和中早39中检测到阳性条带，而在其他三个供试材料中没有检测到目的条带。、和四个抗性基因的特异性分子标记在9个供试材料中都检测到阳性条带。在嘉育293和嘉育253中未检测到阳性条带。在嘉育293和陆青早1号中未检测到阳性条带。值得注意的是，金早47、中组3号和中早39的基因型完全一致，本研究的抗性基因分子标记均能检测到阳性条带。

图2 稻瘟病抗性基因分子标记检测

Fig. 2. Molecular detection of the blast resistant genes.

Marker－DL2000。1~9分别代表浙辐802、嘉育293、湘早籼1号、青谷矮3号、陆早青1号、金早47、中组3号、嘉育253和中早39。CK+自上而下分别为-IRBL9-W、-地谷、-地谷、-Kasalath、-IRBLz-Fu、-IRBLb-B和-羊毛谷。CK-均为H2O。

Marker, DL2000. 1, Zhefu 802; 2, Jiayu 293; 3, Xiangzaoxian 1; 4, Qinggu’ai 3; 5, Luqingzao 1; 6, Jinzao 47; 7, Zhongzu 3; 8, Jiayu 253; 9, Zhongzao 39. From top to bottom, CK+ represent-IRBL9-W,-Digu,-Digu,-Kasalath,-IRBLz-Fu,-IRBLb-B and-Yangmaogu, respectively. CK-, H2O.

图3 氨基酸序列比对分析

Fig. 3. Alignment analysis of amino acid sequences.

2.3 抗性基因序列分析

中早39和春江糯遗传群体定位结果表明，中早39在所在的分子标记区间含有一个主效抗稻瘟病基因[5]。结合本研究的表型鉴定结果，中早39对5个稻瘟病生理小种的抗性表现与地谷一致，将的序列作为研究重点。将供试材料中等位基因的序列与其参考序列(：FJ915121)比较[8]，供试材料中共检测到5个多态性位点，氨基酸多态性频率为0.00062；检测到3个单倍型，单倍型多态性频率为0.556。将DNA序列转换为氨基酸系列，与参考氨基酸序列(PID2：ACR15163.1)相比，供试材料中共检测到两个非同义突变D95N和H686R。其中，D95N由天冬氨酸突变为天冬酰胺，仅在金早47中检测到；而H686R出现在所有的供试材料中，由组氨酸突变为精氨酸。

3 讨论

在水稻抗病育种实践中，明确抗病亲本中抗性基因型可以更有效地应用于育种实践[12-14]。对中早39的抗稻瘟病的遗传背景研究，有助于从分子水平了解抗性基因在中早39中的来源与分布情况，为水稻稻瘟病抗性育种提供理论支持。

分子标记检测结果表明中早39中含有本研究中用到的所有抗性基因位点和，从一个方面解释了中早39具有持久和广谱的稻瘟病抗性的原因。金早47和中组3号具有与中早39完全一致的基因型。田间接种鉴定的结果表明金早47、中组3号和中早39具有相同的抗谱。田间接种鉴定结果含有和的地谷具有与中组3号、金早47和中早39完全一致的抗谱，对稻瘟病生理小种14-754表现感病，对其他4个生理小种表现抗病，说明14-754可以侵染携和抗性基因的水稻品种

前期的研究我们在中早39中所在的分子标记区间检测到一个主效抗性基因位点(t)[5]，定位于水稻第6染色体上近着丝粒区域，与RM527和RM3连锁，遗传距离分别为3.2 cM和3.4 cM[15]。序列分析表明，中早39中的等位基因与参考序列相比具有一个非同义突变H686R，且这个突变普遍存在于所有的供试材料中。Li等[16]在35个亚洲栽培稻和6个野生稻中检测到三个非同义突变S321L、I441M和H686R，其中H686R在所有的供试材料中均被检测到，说明非同义突变H686R是普遍存在的。本研究中，所有的供试材料在第441个氨基酸均为异亮氨酸(I)，所以均为抗病等位基因。稻瘟病菌14-754使供试材料包括中早39、中组3号、金早47和地谷的抗病等位基因失去抗性，而浙辐802、嘉育293、湘早籼1号、青谷矮3号、陆青早1号中可能存在其他的抗性基因，对14-754表现抗病。后续实验可利用稻瘟病生理小种14-754，将这5个材料中对14-754的抗性基因导入到中早39中，以提高其抗谱。

本研究从田间稻瘟病接种鉴定、稻瘟病抗性基因分子标记检测和抗性基因测序分析3个方面证明，中早39的稻瘟病抗病特性经中组3号，来源于金早47。通过分析稻瘟病抗性基因的序列，确定中早39系谱中的供试材料均含有等位基因。

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Genealogical Analysis on Resistance toof Super Early Rice Zhongzao 39

LIANG Yan1, JI Zhijuan1, ZENG Yuxiang1, ZHANG Cuizhen2, WU Hanlin1, YANG Changdeng1,*

(1State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006, China;2College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou 434023, China;*Corresponding author, E-mail: yangchangdeng@126.com)

【Objective】To clarify the genetic basis of the durable resistance toof the super early rice Zhongzao 39,【Method】blast resistance assessment, molecular marker screening and gene sequencing were conducted.【Result】Zhongzao 39, Jinzao 47 and Zhongzu 3 showed positive bands to all the molecular markers for 7 resistant genes,,,,,and; The resistance performance of Zhongzao 39, were fully consistent with Jinzao 47 and Zhongzu 3 to the 5 isolates collected from Zhejiang and Jiangxi Province, China; Molecular sequencing results showed that all the test materials containresistant alleles. 【Conclusion】These results showed that the genetic basis of durable resistance toof Zhongzao 39 was contributed by Jinzao 47 and Zhongzu 3.

molecular marker; resistant gene; gene sequencing; genealogical analysis

10.16819/j.1001-7216.2017.6165

S435.111.4+1; S511.034

A

1001-7216(2017)04-0441-06

2016-09-21;

中央级公益性科研院所基本科研业务费资助项目(2014RG001-3)。

修改稿收到日期：2017-03-23。