猪胎盘冻干粉对小鼠免疫功能的促进作用

王 丹， 何 浪， 刘树立， 尹学蓉， 周再勇， 孙 群

（1.成都医学院生物医学系，四川 成都 610500；2.成都希望食品有限公司，四川 成都 611430；3.四川大学生命科学学院，四川 成都 610064）

猪胎盘冻干粉对小鼠免疫功能的促进作用

王 丹1， 何 浪1， 刘树立2， 尹学蓉2， 周再勇2， 孙 群3

（1.成都医学院生物医学系，四川 成都 610500；2.成都希望食品有限公司，四川 成都 611430；3.四川大学生命科学学院，四川 成都 610064）

为探究猪胎盘冻干粉对小鼠免疫功能的影响，将110只6～8周龄的昆明小鼠随机分为空白对照、阳性对照、高剂量实验组、低剂量实验组，采用经口灌胃给药法，连续给药35 d后，测定各组小鼠的胸腺、脾脏等免疫脏器指数、腹腔巨噬细胞的吞噬百分率，和ConA刺激后外周血T淋巴细胞转化率。结果显示：猪胎盘冻干粉高剂量组显著提升小鼠脾脏指数（P＜0.05），但对胸腺指数影响不明显（P＞0.05）；冻干粉所有剂量组的腹腔巨噬细胞吞噬活性及外周血T淋巴母细胞转化率均显著提高（P＜0.05），其中雄性组效果更明显，表明猪胎盘冻干粉具有增强小鼠机体免疫功能的作用。

猪胎盘冻干粉；促进；小鼠；免疫功能

0 引 言

现代生物医药研究表明，人胎盘中含有丰富的铁、锌、锰等微量元素[1-2]和18种常见氨基酸、磷脂、多糖，以及多种抗体、干扰素、催乳素、促性腺激素等生物活性物质，是一种较为理想的免疫调节剂和保健品[3-5]。然而，人胎盘获取的有限性及伦理学等问题严重阻碍了其相关产品的开发和应用。随着国内外对胎盘制品需求量的日益增大，与人胎盘组织结构相似的动物胎盘已成为热点[6-7]，目前研究较多的是羊胎盘、鹿胎盘等[8-9]。现有文献表明羊胎盘中含有谷氨酸等15种常见氨基酸，其中8种为必需氨基酸；以及超氧化物歧化酶等多种酶类，透明质酸刺激因子和表皮细胞生长因子等生物活性物质[10-11]。郑润宽等[12]检测了羊胎盘转移因子注射液对家兔T淋巴细胞数量与活性的影响，及其对小鼠淋巴细胞的活化作用。其研究结果显示，羊胎盘转移因子注射液具有显著增加淋巴细胞数量与活性的作用，可明显地提高淋巴细胞的转化率。由此可见，羊胎盘转移因子注射液具有改善和提高受试动物特异性细胞免疫的功能。

相比之下，来源广、数量大、成本更加低廉的猪胎盘相关研究还处于起步阶段。例如，Tang等[13]利用响应面优化法建立了猪胎盘水溶性蛋白质的最佳提取工艺。李晓梅等[14]明确了猪胎盘水提物具有抗氧化及改善小鼠记忆力的作用。而胡成波等[15]将猪衣烘焙研磨，加入适量的水和白酒后灌胃给瘦弱型母猪，不仅增加了母猪的抗病能力，而且对母猪不孕症还有明显的治疗作用。

传统的烘培加工技术，虽然简单易行，但是高温处理环节会对胎盘中的活性物质造成严重的破坏。而冷冻干燥是近年发展起来的一种快速冻结、真空冰状脱水的特殊食物加工方法，可最大限度地保持原新鲜食品的色香味及营养成分、物料外观等。并且，冻干粉无须防腐剂就可在常温下保存5年以上，成品质量轻，便于携带、运输和加工。前期研究中，本实验室建立了猪胎盘冻干粉的制备工艺。国内尚未见到猪胎盘冻干粉促免疫的相关报道。鉴于此，本文以昆明小鼠为实验对象，探究猪胎盘冻干粉的促免疫作用，为其相关产品的开发和应用提供理论和实验依据。

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂

猪胎盘冻干粉原料由成都希望食品有限公司提供，水分小于3.54%±0.11%；刀豆蛋白ConA、脂多糖LPS、四甲基偶氮唑盐（MTT）等购自Sigma公司；DMEM培养基、新生胎牛血清、PBS等购自Hyclone公司；淋巴细胞分离液、DMSO等购自四川辰马生物有限公司；其他生化试剂购自成都科龙化工试剂厂。

1.2 实验动物

昆明种小鼠110 只，6～8 周龄，（20±2）g，雌雄各半，购自四川达硕生物科技有限公司，公司科技部实验动物生产许可证编号：SCXK（川）2008-24。

1.3 仪器

3131型二氧化碳培养箱，美国Termo Electron Corporation；SB-JS-2型洁净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Xmark型酶标仪，Bio-RAD公司；CKX41型倒置显微镜，日本OLYMPUS公司；SC-3610型低速离心机，科大创新股份有限公司；JJ-2组织捣碎匀浆机，常州国华电器有限公司；XW-80A微型漩涡混合仪，上海沪西仪器分析厂；电子天平，上海精科称量仪器厂；96孔血清凝血板，计数器，微量加样器，灌胃针，手术剪等。

2 方 法

2.1 动物分组及给药

将小鼠随机分为空白对照组、阳性对照组（提取液）、高剂量实验组和低剂量实验组4组，如表1所示。采用经口灌胃给药法，分别给予生理盐水、猪胎盘提取液（蛋白浓度1.90 mg/mL）、高剂量猪胎盘冻干粉悬液和低剂量冻干粉悬液，每天1次，共35d。实验期间保证各组小鼠均自由进食、饮水，自然昼夜照明，室内通风良好，氨浓度＜20mg/L。相对湿度为40%～70%，室温保持在18～22℃。

表1 实验分组

2.2 小鼠的日常行为

注意观察并记录小鼠在实验期间的进食、饮水，行为等变化。

2.3 小鼠体重监测

实验初始，对每只小鼠进行标记并称取、记录小鼠的初始体重；实验过程中，每隔6d再次称取、记录每只小鼠的体重。

2.4 脏器指数测定

末次灌胃后，最后一次测量并记录每只小鼠的体重。再颈椎脱臼处死小白鼠，用灭菌手术剪及镊子取出小鼠的胸腺、脾脏等免疫器官，用电子天平称量并记录。以胸腺、脾脏、肝脏质量（mg）与体重（g）之比作胸腺、脾脏及肝脏指数（指数单位mg/g）[16]。

2.5 腹腔巨噬细胞吞噬实验

鸡红细胞悬液的制备：取鸡翼下的静脉血，按体积比1∶1的量与Alsever液混合，于4℃保存待用。临用前，用生理盐水洗涤两次后，稀释至20%。

连续灌胃35d后，每只小鼠腹腔注射1mL鸡红细胞悬液，轻揉小鼠腹部30min，用颈椎脱臼法处死小鼠。再取2mL灭菌生理盐水注入小鼠腹腔，混合均匀后吸取其腹腔洗液1 mL，滴于载玻片上，制备细胞涂片。瑞氏染液染色后，在油镜下计数，每片计100个巨噬细胞，计算吞噬率。公式如下：

2.6 淋巴细胞转化实验

连续灌胃35d后，将0.3mg ConA注射于每只小鼠的腹腔，再继续饲养72 h后，取尾尖血于装有3%柠檬酸钠的试管中，混匀。再取1滴于载玻片上，均匀涂开，制备细胞涂片，瑞氏染液染色后，在油镜下检查细胞涂片的头、体、尾3部分。并记录转化、未转化的淋巴细胞数，计算淋巴细胞转化率。公式如下：

2.7 数据统计学处理

3 结 果

3.1 记录行为状态

整个实验期间，实验小鼠的采食、饮水情况无异常，精神良好，行为反应敏捷，毛发有光泽，呼吸正常。

3.2 猪胎盘对小鼠体重的影响

由表2可知，以无菌生理盐水、猪胎盘提取液、猪胎盘冻干粉悬液高剂量（0.3mL）、低剂量（0.1mL）灌胃给药35d后，各组昆明小鼠原始体重，以及在给药期间和给药35d后的体重均无显著差异（P＞0.05）。结果表明，猪胎盘对生长期小鼠体重的增长无明显影响，灌胃没有对其造成过营养。

表2 猪胎盘灌胃给药对小鼠体重的影响（±s）

表2 猪胎盘灌胃给药对小鼠体重的影响（±s）

实验分组 0d 6d 12d 18d 24d 30d 35d对照 29.06±2.69 30.62±4.14 31.36±4.56 31.86±5.03 33.13±5.13 33.34±5.10 34.34±5.40提取液 29.17±3.04 31.32±4.49 32.57±5.05 33.32±5.73 33.74±5.77 34.38±5.89 35.18±6.16冻干粉低剂量 29.47±3.82 31.39±5.03 32.54±5.42 33.38±5.70 34.21±6.09 34.52±6.39 35.39±6.41冻干粉高剂量 29.30±3.15 31.36±4.35 32.60±5.10 33.53±5.27 34.38±5.61 34.55±5.75 35.32±6.04

3.3 猪胎盘对小鼠脏器指数影响

4组小鼠在给药35 d后对其脏器指数进行测定，脏器解剖结果见图1。由图可见，实验组的脾脏和胸腺体积无肉眼可分辨的明显变化。

无论是雄性还是雌性，猪胎盘冻干粉高剂量组对昆明鼠脾脏指数均显著提升（P＜0.05），但对胸腺指数影响不明显（P＞0.05）。猪胎盘提取液及冻干粉低剂量组对小鼠免疫器官指数均无显著提升（P＞0.05）（见图2）。此结果提示，猪胎盘冻干粉对小鼠的免疫器官指数有一定的影响。至于冻干粉高剂量组对胸腺指数提高不明显的原因，可能是由于灌胃给药方式对机体的影响相对缓慢，而冻干粉低剂量组及提取液组对脾脏和胸腺指数均无显著提高，则有可能是由于处理时间短、剂量低等原因，具体机制还需进一步研究。

各组肝脏指数与生理盐水对照组之间均无显著差异（见图3），说明小鼠肝脏无损伤，猪胎盘冻干粉悬液及提取液灌胃给药安全无毒。

图1 小鼠脏器解剖

图2 猪胎盘灌胃给药对小鼠免疫器官指数的影响

图3 猪胎盘灌胃给药对小鼠肝脏指数的影响

3.4 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能评价

将小鼠腹腔巨噬细胞涂片，染色，进行显微拍照。在显微镜下，可清楚分辨出鸡红细胞（CRBC）、巨噬细胞（Mφ），以及吞噬多个鸡红细胞的巨噬细胞，见图4。

每片计100个巨噬细胞，计算吞噬率，结果如图5所示。无论是雄性还是雌性小鼠，冻干粉及提取液灌胃35d，均显著提高其腹腔巨噬细胞的吞噬活性，其中雄性冻干粉高剂量、低剂量及提取液组均与对照组比较差异极显著（P＜0.01）。雌性冻干粉高剂量组与对照组比较差异极显著（P＜0.01）。由此提示，灌胃给药作用后，尽管小鼠从免疫脏器指数上仅脾脏有提高，余未见统计学意义，即胸腺免疫细胞数量增加不明显，但是其免疫学功能，即巨噬细胞的吞噬能力显著增强。

图4 小鼠腹腔细胞悬液涂片（10×100）

图5 猪胎盘灌胃给药对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率的影响

3.5 小鼠T淋巴细胞转化水平检测

ConA刺激60h后，小鼠尾静脉取血，取1小滴抗凝血滴在载玻片上，涂开血液，制备细胞涂片，瑞氏染液染色后，在油镜下进行显微拍照，见图6。

每张血细胞涂片检查涂片头、体、尾3部分，记录转化和未转化淋巴细胞数。结果如图7所示，由ConA诱导的小鼠外周血T淋巴母细胞转化率均显著提高，其中雄性冻干高剂量、低剂量及提取液组均与对照组比较差异极显著（P＜0.01），与巨噬细胞吞噬功能类似，其免疫学功能显著增强。

4 结束语

本文将猪胎盘冻干粉悬液经口灌胃给昆明小鼠，连续给药35d后，测定小鼠免疫脏器指数、腹腔巨噬细胞的吞噬率，以及ConA刺激后的外周血淋巴细胞转化率。结果显示，猪胎盘冻干粉虽然对小鼠胸腺指数提高不明显，但可显著提升小鼠脾脏指数，以及腹腔巨噬细胞吞噬活性和外周血T淋巴母细胞转化率。这说明，猪胎盘冻干粉具有增强小鼠机体免疫功能的作用。分析原因，猪胎盘中含有丰富的必需氨基酸、微量元素、核酸、表皮细胞生长因子、透明质酸刺激因子，以及具有免疫活性的生长激素释放因子等[17-18]，这不仅为胚胎发育输送养分，而且为猪胎盘的免疫调节提供了物质基础。下一步拟从分子水平探究猪胎盘冻干粉增强机体免疫活性的作用机制。

图6 小鼠T淋巴细胞转化（10×100）

图7 猪胎盘灌胃给药对小鼠T淋巴细胞转化率的影响

此外，猪胎盘冻干粉对小鼠肝脏无损伤、对小鼠体重无影响，说明猪胎盘冻干粉对机体安全无毒、无过营养负担，可为开发猪胎盘冻干粉提供数据支持。

[1] 郭广英，刘家安.紫河车功效及药理作用探析[J].中药研究中国民间疗法，2014，22（11）：77-78.

[2]王涛.来自人体的药物——紫河车[J].家庭医药，2014（5）：53-53.

[3] 廖前芬，韩绍辉，王玉娟，等.人胎盘组织液对慢性支气管炎、哮喘的治疗[J].特别健康（下），2014（7）：47-47.

[4] 谢骏逸，杨苏.人胎盘脂多糖注射液治疗儿童白癜风疗效观察[J].江苏医药，2013，39（20）：2480-2481.

[5]吴鹏，高诗博，徐军.人胎盘来源Ⅳ型胶原蛋白的提取与纯化[J].中国医药科学，2013（19）：56-57.

[6]师玉淼.猪胎盘功能性肽的分离纯化及其活性的初步研究[D].杭州：浙江农林大学，2013.

[7]王晓然.马胎盘水溶性蛋白提取工艺及其保健功能研究[D].乌鲁木齐：新疆医科大学，2013.

[8] 王晶，林志颖，林立梅，等.牛羊胎盘免疫调节因子的提取及对PANC-I增殖和迁移影响的比较[J].农业生物技术学报，2016，24（12）：1863-1871.

[9] 司义明，田玉华，齐琳，等.梅花鹿鹿胎盘化学成分的初步研究[J].吉林畜牧兽医，2013，34（10）：9-13.

[10]侯银臣，吴丽，刘旺旺，等.羊胎盘免疫活性肽的制备及其活性[J].中国食品学报，2016，16（1）：123-129.

[11]MULUYE R A， BIAN Y， LI W,et al.Placenta peptide can protect mitochondrial dysfunction through inhibiting ROS and TNF-α generation， by maintaining mitochondrial dynamic network and byincreasingIL-6 level during chronic fatigue[J].Frontiers in Pharmacology，2016（7）：328-336.

[12]郑润宽，徐勇，赵忠，等.羊胎盘转移因子注射液细胞免疫调节作用的研究[J].畜牧与饲料科学，2014，35（1）：1-2.

[13]TANG W L， ZHANG M， FANG Z X.Optimization of ultrasound-assisted-extraction of porcine placenta watersoluble proteins and evaluation of the antioxidant activity[J].JournalofFood Science and Technology，2015，52（7）：4042-4053.

[14]李小梅，周云龙，高垚垚，等.猪胎盘水提物对D-半乳糖诱导衰老小鼠抗氧化及学习记忆调节作用的影响[J].中国新药杂志，2016（23）：2696-2700.

[15]胡成波，王洗清.猪胎衣喂猪营养又治病[J].中兽医医药杂志，2011，13（4）：61-61.

[16]林清华.免疫学实验[M].武汉：武汉大学出版杜，1999：49-53.

[17]GROENEN M A M， ARCHIBALD A L， UENISHI H，et al.Analyses of pig genomes provide insight into porcine demography and evolution[J].Nature，2012，491（7424）：393-403.

[18]SHI Y M， XU G Z， NI Q X， et al.The process optimization of antioxidant peptides from pig placenta using enzymatic hydrolysis method[J].The Food Industry，2013（9）：19-28.

（编辑：莫婕）

Promoting immune function in mice by freeze-dried pig placenta

WANG Dan1， HE Lang1， LIU Shuli2， YIN Xuerong2， ZHOU Zaiyong2， SUN Qun3
（1.School of Biomedical Sciences，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；2.Chengdu Xiwang Food Co.，Ltd.，Chengdu 611430，China；3.College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064，China）

To investigate the effect of freeze-dried pig placenta on immune function of mice.110 mice of 6-8 weeks old were randomly divided into blank control group， positive control group，high dose group， low dose group and fed with freeze-dried pig placenta powder for 35 days， and then the immune organ index of thymus， spleen of all groups of mice， the phagocytic percentage ofperitonealmacrophages， the conversion rate ofperipheralblood lymphocytesafterConA stimulation were measured.The results show that the high dosage group significantly improves the spleen index （P＜0.05） of mice， but not thymus index （P＞0.05）.Phagocytic activity of peritoneal macrophage and conversion rate of T lymphocytes of peripheral blood of all dosage groups are obviously increased （P＜0.05）， among which male group is more obvious.Freeze-dried pig placenta can effectively promote the immune function of mice.

freeze-dried pig placenta； promote； mice； immune function

A

1674-5124（2017）06-0050-05

10.11857/j.issn.1674-5124.2017.06.011

2017-02-06；

2017-03-10

王 丹（1977-），女，辽宁辽阳市人，副教授，博士，主要从事生物制药相关研究。

孙 群（1967-），女，四川内江市人，教授，博士，主要从事食品安全研究。