槲皮素对奶牛乳腺上皮细胞抗氧化性能和乳脂合成的影响

陈光明

（江苏联合职业技术学院淮安生物工程分院，江苏淮安223200）

槲皮素对奶牛乳腺上皮细胞抗氧化性能和乳脂合成的影响

陈光明

（江苏联合职业技术学院淮安生物工程分院，江苏淮安223200）

为研究槲皮素对体外培养奶牛乳腺上皮细胞抗氧化性能和乳脂合成的影响，试验将乳腺上皮细胞分成5组，每组培养基中分别含有0、10、20、40和60 μg/mL槲皮素，然后在37℃，5%CO2的培养箱中培养。结果显示：（1）细胞培养24 h和72 h时，与0 μg/mL槲皮素组相比，20 μg/mL和40 μg/mL槲皮素组细胞的活性分别显著提高了13.12%、7.48%和7.83%、29.85%（P＜0.05）。（2）与0 μg/mL槲皮素组相比，20 μg/mL和60 μg/mL槲皮素组的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化氢酶（GSH-Px）活性以及一氧化氮（NO）浓度分别升高了15.52%、19.99%，53.49%、28.23%，36.29%、13.19%和30.42%、39.78%（P＜0.05），MDA含量分别降低了19.29%和32.74%（P＜0.05）。（3）与0 μg/mL槲皮素组相比，添加10 μg/mL槲皮素组细胞的SREBP1、CD36、FAS、PPAR-γ和SCD1基因表达分别显著降低了45.00%、46.53%、26.73%、43.00%和29.00%（P＜0.05）。结果表明，槲皮素能够提高奶牛乳腺上皮细胞的抗氧化性能，促进细胞的增殖；并且能够通过抑制脂肪酸合成和转运相关基因的表达来降低乳脂的合成。

槲皮素；奶牛；乳腺上皮细胞；乳脂

槲皮素，又称栎精，呈黄色针状结晶，属于黄酮类化合物，其广泛存在于植物的花、叶和果实中。研究发现，在蛋鸡的日粮中添加适量的槲皮素能够调节蛋鸡蛋白质、钙及脂质的代谢；提高蛋黄蛋白质和磷脂含量，降低蛋黄胆固醇和甘油三酯含量，进而提高蛋品质（刘红南等2014；张琳等，2013）。另外，槲皮素能够保护鸡精原细胞免受氧化损伤；抑制鸡脂肪合成代谢，进而减少肉鸡脂肪沉积以及对禽流感感染有一定的防治作用（李垚等，2013；潘德敏和罗开健，2011；Mi等，2009）。欧阳文文等（2013）研究发现，槲皮素能够通过调控cAMP信号通路抑制脂肪合成相关基因的表达，进而降低脂肪沉积。王明昊等（2013）研究发现，槲皮素能够调节脂肪细胞内分泌因子TNF-α、ADP和PPAR-γ的生成，从而降低脂肪细胞TG含量。以上结果说明，槲皮素具有抑制机体内脂肪合成的作用。乳腺组织是乳脂合成的主要场所，其在乳腺上皮细胞中合成。本试验通过细胞培养技术，研究槲皮素对奶牛乳腺上皮细胞抗氧化性能和乳脂合成相关基因表达的影响，以此来了解槲皮素对乳脂合成的机制，为槲皮素在动物生产上的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料槲皮素（含量≥98%）由上海源叶生物科技有限公司提供。试验时，将槲皮素溶于二甲基亚砜（DMSO），培养基中DMSO含量为1‰。奶牛屠宰后，剪取乳腺组织，放入含双抗的PBS中，带回实验室进行组织块培养，将纯化的细胞接种在含有10%胎牛血清（Gibco，美国）的DMEM/ F12（Gibco，美国）培养基中，在条件为37℃，5% CO2的培养箱中培养。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞活性检测细胞活性采用CCK-8法进行检测，将细胞密度调整到8.0×104个/mL后接种到96孔板中，在基础培养基中分别加0、10、20、40和60 μg/mL槲皮素，每组5个重复。细胞于37℃，5%CO2培养箱中培养24 h和72 h后，分别在每孔中加入10 μL CCK-8溶液，放回培养箱中继续培养4 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光值，然后计算细胞相对活性。

细胞相对活性=（As-Ak）/（Ac-Ak）×100。

式中:As为试验组（细胞+培养基+槲皮素）；Ac为对照组（细胞+培养基）；Ak为空白组（培养基）。

1.2.2 抗氧化指标的检测将细胞密度调整到1.0×105个/mL后接种到12孔板中，在基础培养基中分别加0、10、20、40和60 μg/mL槲皮素，每组4个重复，培养72 h后，收集细胞上清液进行抗氧化酶类如谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）以及丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）含量的检测。所有指标根据南京建成提供的试剂盒中的方法进行检测。

1.2.3 细胞总RNA的提取和Real Time-PCR条件取密度为2.5×105个/mL细胞接种到6孔板中，在基础培养基中分别加0、10、20、40和60 μg/mL槲皮素，每组4个重复，培养72 h后，收集细胞，然后进行RNA提取，提取方法参照天根生化科技有限公司提供的试剂盒中的说明书。RNA的浓度和纯度经过测定后，根据Takara试剂盒中说明书进行反转录。根据试剂盒说明书在冰上配制PCR反应液，然后进行RT-PCR反应，其反应条件为: 95℃预变性30 s；95℃、5 s，60℃、20 s，循环40次；65℃、15 s。

1.2.4 引物设计根据Gene Bank中的基因序列，采用Primer 5.0软件设计引物，引物由Invitrogen公司合成（表1）。

表1 引物序列

1.3 数据处理基因相对表达量采用2-△△Ct方法进行计算，试验数据以“平均值±标准差”表示，数据采用IBM SPSS 21.0进行单因素方差分析（ANOVA），LSD法进行多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 槲皮素对细胞活性的影响从图1和图2可知，奶牛乳腺上皮细胞培养24 h时，添加20 μg/mL和40 μg/mL槲皮素组的细胞相对活性分别较0 μg/mL槲皮素组显著升高13.12%和7.48%（P＜0.05）；细胞培养72 h时，与0 μg/mL槲皮素组相比，槲皮素组的细胞相对活性分别显著升高了7.83%、20.35%、29.85%和12.13%（P＜0.05），其中40 μg/mL组细胞活性最高。结果表明，槲皮素能够提高细胞活性，促进细胞增殖。

图1 槲皮素对培养24 h细胞活性的影响

图2 槲皮素对培养72 h细胞活性的影响

2.2 槲皮素对细胞抗氧化指标的影响从表2中可知，与0 μg/mL槲皮素组相比，20 μg/mL和 60 μg/mL槲皮素组的SOD、CAT和GSH-Px活性以及NO浓度分别升高了15.52%、19.99%，53.49%、28.23%，36.29%、13.19%和30.42%、39.78%（P＜0.05），MDA含量分别降低了19.29%和32.74%（P＜0.05）。结果表明，槲皮素能够提高细胞的抗氧化能力，进而可以促进细胞的生长。

表2 槲皮素对细胞抗氧化指标的影响

2.3 槲皮素对乳脂合成相关基因表达的影响从表3中可知，与0 μg/mL槲皮素相比，添加10 μg/mL槲皮素组细胞的SREBP1、CD36、FAS、PPAR-γ和SCD1基因表达分别显著降低了45.00%、46.53%、26.73%、43.00%和29.00%（P＜0.05）。结果表明，槲皮素能够降低与脂肪合成相关基因的表达，进而影响乳脂的合成。

表3 槲皮素对乳脂合成相关基因表达的影响

3 讨论

陈静（2012）研究发现，添加12.5～50 μmol/L槲皮素能够提高奶牛乳腺上皮细胞存活率，而添加100～200 μmol/L槲皮素则细胞的存活率降低。说明槲皮素能够促进细胞的增殖，但添加剂量过高则会对细胞增殖有抑制作用。在本试验中，细胞培养24 h和72 h，槲皮素添加剂量在40 μg/mL之内能够提高细胞活性，而超过该剂量则细胞活性有所下降。本结果与陈静研究结果相似。槲皮素添加剂量过高会降低细胞活性的原因可能是槲皮素发挥了抗雌激素的作用所致。

细胞在正常代谢情况下，会产生活性氧（ROS），而体内的抗氧化防御系统能够调节ROS水平，进而使细胞免受ROS的损伤。如果细胞清除ROS能力下降，就会发生氧化应激，造成细胞损伤（杨丽娟和游育红，2010）。研究发现，槲皮素能够提高奶牛乳腺上皮细胞和小鼠腹腔巨噬细胞内的SOD活性和降低MDA含量（陈静，2012；李云峰等，2007）。另外，在过氧化氢刺激下，槲皮素能够提高心肌细胞和PC12细胞内的SOD、CAT和GSH-Px活性和降低MDA含量，进而提高细胞活性（刘红亮等，2014；杨雷等，2006）。本试验所得结果与以上研究结果相似，说明槲皮素能够提高细胞的抗氧化能力，进而提高细胞的生长。NO能够调节上皮细胞正常功能和营养物质的代谢等。乳腺上皮细胞分泌的NO能够增加乳腺血管中血流量，促进泌乳（Vasudevan等，2016）。本试验结果看，添加适量槲皮素可能会增加NO的分泌来促进细胞的增殖。然而，NO含量过高，会对细胞造成损伤。本试验结果表明，添加60 μg/mL槲皮素细胞的NO浓度最高，而抗氧化酶类活性有所下降。说明NO浓度升高，可能会使细胞产生氧化损伤。

乳脂合成主要有两部分，一是由乳腺上皮细胞所吸收的瘤胃微生物发酵产生的乙酸、β-羟丁酸等脂肪酸前体物质在各种酶的催化下合成，另一个是乳腺从血液中获取的脂肪酸。脂肪酸合成酶（FAS）能够通过催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成甘油三酯，进而调控长链脂肪酸的合成（罗建学等，2011）。硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）是多不饱和脂肪酸合成过程中的限速酶，通过敲除该基因发现，在高能日粮条件下小鼠采食增加，但体脂的沉积却降低（张蕊等，2013）。分化抗原簇36（CD36）是一种跨膜糖蛋白，能与多种配基相结合，是长链脂肪酸的转运蛋白，其在乳腺细胞摄取脂肪酸方面起到非常重要的作用。固醇调节元件结合蛋白（SREBP）和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）是调控脂质代谢的转录因子。SREBP1高表达可导致FAS、ACC和PPAR-γ等基因的高表达（许会芬，2012）。敲除PPAR-γ可降低奶山羊乳腺上皮细胞中SCD、SREBP1、FAS等基因表达量（Shi等，2013）。在本试验中，槲皮素降低了SCD1、SREBP1、FAS、CD36和PPAR-γ mRNA的表达。说明槲皮素可能通过抑制SREBP1和PPAR-γ的表达来降低SCD1和FAS的表达，进而降低脂肪酸的合成；另外，槲皮素可抑制CD36的表达，降低脂肪酸的转运，进而降低乳脂的合成。

4 结论

槲皮素能够提高奶牛乳腺上皮细胞的抗氧化能力，进而提高细胞活性；另外，还可通过抑制脂肪酸合成酶和转运蛋白的表达，降低乳脂的合成。

[1]陈静.槲皮素对奶牛乳腺上皮细胞的生物学效应研究：[硕士学位论文] [D].南京：南京农业大学，2012.

[2]李垚，赵伟，欧阳文文，等.槲皮素对肉鸡脂肪细胞脂质代谢作用[J].东北农业大学学报，2013，44（3）：58～65.

[3]李云峰，郭长江，韦京豫，等.槲皮素对小鼠腹腔巨噬细胞氧化应激反应与功能的影响[J].解放军预防医学杂志，2007，25（3）：160～163.

[4]刘红亮，胡磊，王靖凯，等.槲皮素对H2O2损伤PC12细胞的保护效果与机制[J].中国药理学通报，2014，30（3）：373～377.

[5]刘红南，滕楠，李垚，等.饲粮添加槲皮素对蛋鸡蛋品质和蛋组分的影响[J].动物营养学报，2014，26（8）：2246～2252.

[6]罗建学，李春风，初晓辉，等.脂肪酸合成酶基因的研究进展[J].中国畜牧兽医，2011，38（6）：118～122.

[7]欧阳文文，李垚，赵伟，等.槲皮素对肉鸡脂肪细胞环腺苷酸信号通路的作用[J].中国农业科学，2013，46（13）：2769～2776.

[8]潘德敏，罗开健.槲皮素对禽流感病毒感染试验鸡的防治作用[J].广东畜牧兽医科技，2011，36（4）：37～39．

[9]王明昊，李垚，赵伟，等.槲皮素对肉鸡脂肪细胞内分泌因子水平的影响[J].动物营养学报，2013，25（3）：587～594.

[10]许会芬.西农萨能羊乳腺上皮细胞SREBP1基因的过表达及干扰研究：[硕士学位论文][D].杨凌：西北农林科技大学，2012.

[11]杨丽娟，游育红.细胞受到氧化应激后损伤的检测方法[J].医学综述，2010，16（6）：924～927.

[12]杨雷，郭青榜，卢艳，等.槲皮素对过氧化氢所致体外心肌细胞损伤的保护作用[J].中国临床康复，2006，10（3）：60～62.

[13]占今舜，邢月腾，张彬.细胞培养技术的应用研究进展[J].饲料博览，2013，1：8～11.

[14]张琳，李垚，冯香安，等.槲皮素对蛋鸡生产性能及脂类代谢的影响[J].中国畜牧兽医，2013，40（1）：89～92.

[15]张蕊，张宜辉，邵丹，等.硬脂酰辅酶A去饱和酶基因的功能与调控[J].生命科学，2013，25（4）：378～382.

[16]Mi Y，Zhang C，Li C M，et al.Quercetin protects embryonic chicken spermatogonial cells from oxidative damage intoxicated with 3-methyl-4-nitrophenol in primary culture[J].Toxicology Letters，2009，190：61～65．

[17]Shi H，Luo J，Zhu J，et al.PPAR γ regulates genes involved in triacylglycerol synthesis and secretion in mammary gland epithelial cells of dairy goats[J]. Ppar Research，2013，6：1～10.

[18]Vasudevan D，Bovee R C，Thomas D D.Nitric oxide，the new architect ofepigenetic landscapes[J].Nitric oxide，2016，59：54～62.■

The objective of this study was to examine the effects of quercetin on antioxidant properties and milk fat synthesis of bovine mammary epithelial cell cultured in vitro.The bovine mammary epithelial cells were divided into 5 groups and cultured in medium with 0，10，20，40 and 60 μg/mL of quercetin，respectively.The cells of each group were cultured in a cell incubator of 37℃，5%CO2.The results showed as follows:（1）Compared with the group of 0 μg/mL quercetin，the activity of cells cultured for 24 h and 72 h in the groups of 20 μg/mL and 40 μg/mL quercetin were increased by 13.12%，7.48%and 7.83%，29.85%，respectively（P＜0.05）.（2）Compared with the group of 0 μg/mL quercetin，the activity of superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT），gluta thione peroxidase（GSH-Px）and the NO concentration in the groups of 20 μg/mL and40 μg/mL quercetin were increased by 15.52%，19.99%；53.49%，28.23%；36.29%，13.19%and 30.42%，39.78%，respectively（P＜0.05），the malonaldehyde（MDA）content were decreased by 19.29%and 32.74%，respectively（P＜0.05）.（3）Compared with the group of 0 μg/mL quercetin，the relative express of SREBP1，CD36，FAS，PPAR-γ and SCD1 in the group of 10 μg/mL quercetin were decreased by 45.00%，46.53%，26.73%，43.00%and 29.00%，respectively（P＜0.05）.In conclusion，quercetin could increase the antioxidant ability of cells and promote cell proliferation，decrease the milk fat synthesis by inhibiting the expression of gene on the synthesis and transport of fat acid.

quercetin；dairy cow；mammary epithelial cell；milk fat

S816.7

A

1004-3314（2017）13-0016-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171304