枯草芽孢杆菌Bs—15对柿树炭疽病的离体防治效果

余贤美+侯长明+王洁+张坤鹏+艾呈祥

摘要：为探讨枯草芽孢杆菌Bs-15对柿树炭疽病的防治潜能，通过平板对峙试验研究Bs-15对柿树炭疽病菌的抑制作用，并通过离体接种试验，研究Bs-15对柿树炭疽病的防治效果。结果显示，在对峙平板中形成稳定而明显的抑菌带，宽为（0.56±0.05）cm；离体接种试验中，先接种Bs-15菌悬液后接种菌饼处理比先接种菌饼再接种Bs-15菌悬液处理对柿树炭疽病的防治效果好，其抑制率分别为54.76%和47.62%，防治效果分别为78.54%和70.04%，说明枯草芽孢杆菌Bs-15可能通过产生诱导抗性提高防效。本试验结果表明，枯草芽孢杆菌Bs-15对柿树炭疽病有较好的防治效果，可作为潜在的生防菌株，为柿树炭疽病的防治提供新的途径和方法。

关键词：枯草芽孢杆菌；柿树炭疽病；哈锐炭疽菌；平板对峙试验；离体接种试验

中图分类号：S436.65 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）07-0125-03

Abstract To investigate the control potential of Bacillus subtilis Bs-15 on persimmon anthracnose， the inhibition of Bs-15 to Colletotrichum horri was studied via dual-culture test， and the control effect of Bs-15 on persimmon anthracnose was studied via in vitro inoculation experiment. The results showed that the inhibition zone in dual-cultured plate was （0.56±0.05）cm. The in vitro inoculation experiment showed that the control effect of spraying the bacterium suspension of Bs-15 before inoculating the pathogenic disk was better than that of spraying the bacterium suspension of Bs-15 after inoculating the pathogenic disk with the inhibition ratio of 54.76% and 47.62% and the control efficiency of 78.54% and 70.04%， respectively. It indicated that Bs-15 might have better control efficiency by producing the induced resistance. The results indicated that because of good effect on persimmon anthracnose， Bs-15 could be used as a potential biocontrol bacterial strain and provide a new path and method for control of persimmon anthracnose.

Keywords Bacillus subtilis； Persimmon anthracnose； Colletotrichum horri； Dual-culture test； In vitro inoculation experiment

柿树炭疽病是危害柿树的一种毁灭性病害，严重时可造成巨大的经济损失，已成为阻碍柿树产业发展的重要因素[1，2]。对于柿树炭疽病的防治，在加强栽培管理措施的基础上，仍以化学防治为主要手段，而多年连续使用，已使病原菌产生抗药性，同时还造成农药残留、环境污染等问题，甚至危害人类健康[3-5]。

生物防治是一种环境友好型的防治方法，具有广泛的应用价值，已成为病害防治的热点。芽孢杆菌是目前生防细菌中被研究較多的一类，尤其是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。枯草芽孢杆菌是一类重要的生防菌，对多种植物病原真菌具有抑制作用，对茄子立枯病、甜椒枯萎病、大豆根腐病、橡胶炭疽病、桑椹腐烂病、棉花黄萎病、玉米纹枯病、梨褐腐病、水稻稻瘟病、葡萄霜霉病等病害，均具有较好的防治效果[6-10]，说明枯草芽孢杆菌在生物防治方面具有广泛的应用前景。本课题组分离鉴定的枯草芽孢杆菌Bs-15对甜椒枯萎病菌的抑制率达93.15%，防效达56.94%[11，12]，在生物防治方面具有一定潜能。

本课题通过室内平板对峙试验和离体接种试验，研究枯草芽孢杆菌Bs-15对柿树炭疽病菌的抑制作用和对柿树炭疽病的防治效果，以探讨该菌株在柿树炭疽病防治方面的应用潜能，为柿树炭疽病的防治提供可行的途径和方法。

1 材料与方法

1.1 材料

枯草芽孢杆菌Bs-15为本课题组分离保存；柿树炭疽病菌哈锐炭疽菌Colletotrichum horri分离自山东省果树研究所万吉山试验基地柿子园三年生牛心柿树[13]；离体接种所用柿树叶片采自山东省果树研究所万吉山试验基地柿子园三年生健康牛心柿树。

1.2 平板对峙试验

1.2.1 接种菌液的制备 将Bs-15接种到LB液体培养基中，于37℃振荡培养过夜，备用。

1.2.2 菌饼的制备 将柿树炭疽病菌接种于PDA培养基平板中，28℃恒温培养5天，用打孔器从菌落边缘取直径为5 mm的菌饼，备用。

1.2.3 室内平板对峙试验 按5点接种法进行接种。将病原菌菌饼接种于PDA培养基平板中央，在菌饼四周用接种针对称等距离点接Bs-15菌液，重复3次。于28℃条件下培养7～10天，观察两种菌的生长情况及抑菌带，待形成稳定的抑菌带后测量其宽度并求平均值。

1.3 室内离体接种试验

1.3.1 菌悬液的制备 将Bs-15接种到LB液体培养基中，于37℃振荡培养过夜，用10 mmol/L无菌硫酸镁溶液制备成菌悬液，使菌体数约为106～107 cfu/mL。

1.3.2 菌饼的制备 离体接种所需菌饼的制备，同1.2.2。

1.3.3 离体接种 取柿子叶片，用无菌大头针刺伤形成伤口，采用以下2种方式进行接种：①先喷Bs-15菌悬液，两天后再于伤口处接种柿树炭疽病菌菌饼；②于伤口处先接种柿树炭疽病菌菌饼，两天后再喷Bs-15菌悬液。每处理接种30片叶片，以接种菌饼+喷无菌硫酸镁溶液为对照，重复3次。于28℃条件下保湿培养，观察病斑的形成，于第7天统计发病率。按照邓维萍等[14]的方法测定病斑面积S，不发病记为0级（-）；1级（+）：S≤1 cm2；2级（++）：1 cm24 cm2，并统计各处理不同病级的叶片数。

根据以下公式计算抑制率、病情指数及防治效果。

抑制率（%）=（对照发病率-处理发病率）/对照发病率×100 ；

病情指数=Σ（各级病叶数×相应病级）/（叶片总数×最高病级）×100 ；

防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100 。

2 结果与分析

2.1 Bs-15对柿树炭疽病菌的拮抗作用

接种平板，于28℃条件下培养7天后，形成了稳定而明显的抑菌带，带宽为（0.56±0.05）cm（图1）。说明枯草芽孢杆菌Bs-15对柿树炭疽病菌有较强的拮抗作用。

2.2 Bs-15对柿树炭疽病的离体防效

表1可见，对照发病叶片的病级主要集中在3级，其次是2级，部分叶片病级为4级和5级；2个处理发病叶片的病级主要集中在1级，其次是2级，无4级和5级病叶。表2可见，Bs-15极显著降低了柿树炭疽病的发病率和病情指数；菌悬液喷施时间对防治效果有显著影响，先喷施Bs-15菌悬液再接种炭疽病菌菌饼的效果明显高于先接种炭疽病菌菌饼再喷施Bs-15菌悬液，前者抑制率为54.76%，防治效果为78.54%，后者抑制率为47.62%，防治效果为70.04%。

3 讨论与结论

为探讨枯草芽孢杆菌Bs-15对柿树炭疽病的防治效果，本课题通过室内平板对峙试验研究了枯草芽孢杆菌Bs-15对柿树炭疽病菌的拮抗作用，结果显示，Bs-15对柿树炭疽病菌具有较好的拮抗作用，在对峙平板上形成了稳定而明显的抑菌带，带宽为（0.56±0.05）cm。然后通过离体接种试验研究了Bs-15对柿树炭疽病的防效，发现对照发病叶片的病级主要集中在3、2级，而接种处理发病叶片主要集中在1、2级，该结果与笔者之前的接种结果[13]相一致；菌株Bs-15显著降低了柿树炭疽病的发病率和病情指数，而且菌悬液的喷施时间对防治效果有显著影响，先喷菌悬液再接菌饼效果明显高于先接菌饼再喷菌悬液，说明，Bs-15有可能通过产生诱导抗性提高防治效果[15]。但是，由于本试验采用室内离体接种的方法进行，其环境相对稳定，影响因子单一，防治效果相对较高，而对于在环境相对复杂的盆栽试验或田间试验，该菌株对柿树炭疽病的防治效果有待于进一步研究。

参 考 文 献：

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