头花龙胆组织培养繁殖技术

郭美+刘欣颖+卢虹+梁露+孙爱群+林文敏

摘 要：为获得优良健壮的组培苗，建立头花龙胆的无性快繁体系，以六盘水采头花龙胆茎段为外植体，进行愈伤组织的诱导与分化、芽的增殖与继代、根的分化培养。结果表明：MS+NAA0.2mg/L+6BA0.4mg/L培养基适宜诱导，诱导率为93.3%；MS+NAA0.1mg/L+6BA0.3mg/L培养基适宜增殖分化，增殖系数达10.2；MS+NAA0.1mg/L+6BA0.1mg/L培养基适宜生根，接种30d即可生根，生根率100%，同时也适宜增殖。

关键词：头花龙胆；组织培养；快速繁殖；茎段

中图分类号 Q946.5 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）13-0034-03

Culture and Rapid Propagation of Tissue of Gentiana Cephantha

Guo Mei et al.

（Department of Biology Science，Liupanshui Normal University，Liupanshui 553004，China）

Abstract：In order to obtain excellent robust plantlets of Gentiana cephantha，the asexual rapid propagation system of Gentiana cephantha was established. Stems as explants，induction and differentiation of callus，bud proliferation and subculture，differentiation of culture root were studied. The results showed that MS+NAA0.2mg/L+6BA0.4mg/L medium was suitable for induction，the induction rate was 93.3%；MS+NAA0.1mg/L+6BA0.3mg/L culture base was suitable for proliferation and differentiation，proliferation coefficient was 10.2. MS+NAA0.1mg/L+6BA0.1mg/L was the suitable culture medium for rooting，and the culture medium was also suitable for proliferation.

Key words：Gentiana cephantha.；Tissue culture；Rapid propagation；Stem segment

头花龙胆（Gentiana cephalantha）分布于云南、四川、贵州、广西等地，生于海拔1800～4450m的山坡草地、山坡路边、灌丛中、林缘、林下[1]。为多年生草本，花簇生枝端呈头状（花果期9-12月）[2]，具有泻肝火、清下焦、除湿热之功效，主治目赤肿痛、湿热黄疸、头痛、胆囊炎、疮疡肿毒、外阴瘙痒等[3]。

头花龙胆是我省重要的中草药，民间用头花龙胆代替坚龙胆入药，野生资源已日趋匮乏。目前有关头花龙胆的研究，主要在资源调查[2，4]、形态学[5]、种子萌发[6]、化学成分[7-8]及龙胆苦苷含量测定[9-10]方面，而头花龙胆组织培养及快速繁殖鲜为报道。本实验对头花龙胆进行组织培养与快速繁殖试验研究，旨在建立头花龙胆的无性快繁体系，从而快速繁殖种苗，为人工种植奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 头花龙胆采自六盘水市钟山区梅花山，选其幼茎作为外植体进行诱导培养。

1.2 方法

1.2.1 外植体的处理 将头花龙胆幼茎切成1～2cm长的茎段，洗衣粉水清洗30min，然后流水冲洗30～60min，置超净工作台，用75%的酒精消毒15～20s，弃酒精后无菌水清洗3～4次，每次3min，再用0.15%的升汞消毒8～10min，弃升汞后无菌水清洗6～8次，每次3min，最后把外植体放入无菌培养皿中，备用。

1.2.2 培养基与培养条件 培养基：基本培养基为MS培养基，添加外源激素6BA和NAA的不同浓度，蔗糖30g/L，琼脂12g/L，pH5.8培养条件：培养温度约25℃，光照时间12h/d，光照强度1500lx。

1.2.3 丛生芽的诱导 在超净工作台上，将外植体接种到不同丛生芽的诱导培养基上。每种丛生芽诱导培养基接种5瓶，每瓶接种3个外植体，接种完毕，贴上标签，注明日期及6BA和NAA的浓度等。

诱导率（%）=诱导数/外植体接种数×100

1.2.4 丛生芽芽苗的继代与增殖 将丛生芽苗转接到继代增殖培养基中进行增殖培养。统计增殖系数（增殖系数=外植体增殖芽苗数/接种芽苗数）。

1.2.5 生根培养 将增殖的丛生芽分成单株接种于生根培养基上培养，记录生根情况。

2 结果与分析

2.1 不同浓度NAA及6BA组合对丛生芽诱导的影响 不同浓度的NAA及6BA对丛生芽诱导的影响见表1。由表1可知，NAA为0.2mg/L时，丛生芽的长势较好，且丛生芽数也较多；当NAA为0.2mg/L，6BA为0.4mg/L时，丛生芽数是最多的，所以MS+NAA0.2mg/L+6BA0.4mg/L的培养基是诱导头花龙胆形成丛生芽的适宜培养基。

2.2 不同浓度NAA及6BA组合对丛生芽芽苗继代与增殖的影响 由表2可知，在不同浓度的NAA和不同浓度的6BA组合的培养基上，丛生芽均有分化，当NAA为0.1mg/L时，丛生芽的增殖系数较大，最高达10.2，NAA 0.1mg/L、6BA0.3mg/L时，丛生芽增殖分化出的苗数最多且长势较好，所以MS+NAA0.1mg/L+6BA0.3mg/L的培养基是头花龙胆丛生芽增殖分化较适合的培養基。

2.3 不同濃度NAA及6BA组合对头花龙胆生根的影响 不同浓度的NAA及6BA对头花龙胆生根影响见表3。头花龙胆接种至生根培养基后，30d可以长出根。当NAA为0.1mg/L、6BA为0.1mg/L时，头花龙胆组培苗的根粗壮且根较长，并且根数最多，达22.67±4.04根，生根率为100%，所以MS+NAA0.1mg/L+6BA0.1mg/L的培养基是头花龙胆生根的适宜培养基。该培养基培养的头花龙胆组培苗的分枝数为12±2个、茎高为3.5±0.3cm，分枝数最多，茎增长最高，因此，该培养基既是头花龙组培苗生根的适宜培养基，又是分化增殖适宜培养基。

3 讨论

龙胆组培苗的种植与传统的龙胆种子种植比较，传统的龙胆种子种植存在缺陷，首先，龙胆种子采集较困难且保存期限短，使用年限仅为一年[11]，还受季节限制；而龙胆组培苗培养时间短，不受季节限制，通过继代培养可以快速得到较多的组培苗，能够满足人们的需求。其次，龙胆种子种植后发芽率较低，成苗率低；而龙胆组培苗移栽后注意保温保湿成活率可达90%以上。第三，龙胆种子发芽后，幼苗还需移栽，且通常2～3a龙胆苗才能开花结果[12]，生长周期较长；而龙胆组培苗移栽后当年就能开花结果，生长周期较短。所以通过组织培养可快速繁殖幼苗，加快龙胆的生产，满足人们的需求。

郭治友等[13]对都匀龙胆草进行了快繁，认为较适合丛生芽增殖的培养基为MS+6-BA1.1mg/L+IBA 1.0mg/L，增殖系数达8.6；文伟等[15]对龙胆草进行了快繁，认为MS+AgNO3 1.2mg/L+6-BA 0.6mg/L+NAA 0.1mg/L是愈伤组织及不定芽分化培养的适宜培养基，经过45d的培养，平均1个分化芽能培养形成4.8个长势旺盛的丛生状不定芽。本实验不同浓度6BA与NAA的组合培养基，得到的丛生芽增殖系数不同，增殖系数在3.20～10.2，增殖系数最大的培养基为MS+NAA0.1mg/L+6BA0.3mg/L，增殖系数为10.2，说明6BA与NAA不同浓度组合对组培苗丛生芽的增殖系数有较大影响，两者浓度比为3∶1时，增殖系数较大。本实验的增殖系数较郭治友、文伟的高，且从成本考虑，本实验更为经济。

顾地周等[16]对高山龙胆用1/2MS+IAA 0.05的培养基培养21d，长出7～10条不定根；培养35d，根长达3.0cm以上。赵志莲[17]通过对龙胆草的快繁，认为较适合的生根培养基为1/2MS+IBA0.05mg/L，经过30d左右培养可以得到根长为3cm的植株。本实验较适合的生根培养基为：MS+NAA0.1mg/L+6BA0.1mg/L，经过30d左右培养，根数为22.67±4.04，根长为3cm左右，说明高山龙胆、深红龙胆、红花龙胆及头花龙胆的根生长速度较为一致，不同浓度生长素对生长速度影响不大。本实验的生根培养基生根数更多，更适合植株生根，低浓度的6BA与NAA的组合，也可促进生根。本实验还发现头花龙胆在培养基中可以开花，只要合理掌握花期就可以使头花龙胆在想要的时间内开花，使人能够更容易观赏，利用组织培养进行快速繁殖大大缩短了育苗时间，为人工栽培奠定了基础，具有重要的现实意义。

参考文献

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[16]顾地周，赵淑玲，杨静秋，等.高山龙胆的离体培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯，2009，（6）：13962-13963.

[17]赵志莲.快繁龙胆草[J].植物杂志，2002（6）：29.

（责编：施婷婷）