华木莲茎段组织培养初探

尤 润，王玲玲，曹璐瑶，廖文轩，邢梦雪，王文秀，钟丽萍，郑丽丽，肖祖飞*

（南昌工程学院水利与生态工程学院，江西南昌 330099）

华木莲（Sinomanglietia glauca）是1988年在江西省宜春明月山首次发现，1994年俞志雄发表该树种，并建立华木莲属[1]。华木莲，木兰科落叶乔木，树干通直，树形优美，花香沁人心脾近乎幽兰，花色淡黄典雅宛若睡莲，金秋硕果累累，分布于江西和湖南个别地方，是我国特有珍稀濒危树种，也是优良的园林绿化树[2]。以华木莲一年生半木质化枝条为材料，研究消毒时间、基本培养基和激素对华木莲茎段组织培养的影响，旨在为更好保护、开发与利用濒危物种华木莲。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料来自南昌工程学院木兰园的华木莲。2015年6 月份选取生长健壮的华木莲植株，剪取当年生半木质化枝条，将枝条修剪成带1～2 个芽的茎段，待用。

1.2 试验方法

1.2.1 消毒时间对华木莲茎段诱导培养的影响。将修剪好的茎段放入无菌罐头瓶，75%酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗3～5 次，用0.1%的氯化汞（HgCl2）进行消毒，消毒时间分别为5、6、7、9 和12min，用无菌水冲洗3～5次，茎段放在无菌滤纸上吸干表面水分，接种在MS+1.5mg/L6-BA+0.2mg/LIBA 培养基，每个处理30 瓶，每瓶1～2 个茎段。

1.2.2 基本培养基对华木莲茎段诱导培养的影响。将修剪好的茎段放入无菌罐头瓶，75%酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗3～5 次，再用0.1%的氯化汞进行消毒7min，用无菌水冲洗3～5 次，茎段放在无菌滤纸上吸干表面水分，接种在DCR 和MS 基本培养基，培养基添加1.5mg/L6-BA+0.2mg/LIBA。每个处理60 瓶，每瓶1～2 个茎段。

1.2.3 激素浓度对华木莲茎段萌芽诱导培养的影响。将修剪好的茎段放入无菌罐头瓶，75%酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗3～5 次，再用0.1%的氯化汞进行消毒，消毒时间分别为7min，用无菌水冲洗3～5 次，茎段放在无菌滤纸上吸干表面水分，接种在MS 培养基，添加6-BA（0.5mg/L、1.00mg/L、1.50mg/L、2.00mg/L、3.00 mg/L），IBA （0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L）。每个处理20 瓶，每瓶1～2 个茎段。

1.3 数据统计与分析

采用Excel2010 软件进行数据的录入、整理和方差分析。主要调查指标如下：存活率（%）=（存活的外植体数／接种的外植体数）×100；污染率（%）=（污染的外植体数／接种的外植体数）×100；褐化率（%）=（褐化的外植体数／接种的外植体数）×100；萌芽率（%）=（萌芽的外植体数／接种的外植体数）×100；愈伤率（%）=（诱导出愈伤组织的外植体数／接种的外植体数）×100。

2 结果与分析

2.1 消毒时间对华木莲茎段培养的影响

由表1 和图1 可知，随着消毒时间的增加，华木莲茎段组织培养污染率逐渐降低，华木莲茎段消毒5min，污染率超过50%，与消毒6min 差异不显著，显著高于消毒7min、9min 和12min，消毒9min 和12min，污染率均低于20%。随着消毒时间的增加，褐化率逐渐升高，华木莲茎段消毒5min 和6min，褐化率较低，低于10%，之间差异不显著；消毒7min，褐化率较低，为15.63%；消毒时间超过9min，褐化率显著提高，显著高于5min、6min 和7min。随着消毒时间的增加，存活率和萌芽率呈现先升后降的变化趋势。消毒7min，存活率和萌芽率达到最大值，分别为31.25%和20.63%，显著高于其它消毒时间。因此，华木莲茎段组织培养消毒最佳时间为7min。

表1 消毒时间对华木莲茎段培养的影响

2.2 基本培养基对华木莲茎段培养的影响

图1 华木莲茎段组织培养，由左至右依次为茎段萌芽、污染和褐化

选择适当的基本培养基，对于组织培养成功至关重要。由表2 可知，华木莲茎段组织培养采用MS 培养基褐化率低于DCR 培养基，存活率、愈伤率和萌芽率高于DCR 培养基，之间差异显著。采用MS 培养基，茎段容易诱导产生愈伤组织（图2），腋芽萌芽也较快。因此，华木莲茎段组织培养适宜基本培养基为MS 培养基。

2.3 不同激素浓度对华木莲茎段培养的影响

表2 不同基本培养基对华木莲茎段诱导培养的影响

图2 不同基本培养基对华木莲茎段培养的影响左图为MS 培养基，右图为DCR 培养基

由表3 可知，在IBA 浓度不变的情况下，随着6-BA 浓度的增加，华木莲茎段的萌芽率呈现逐渐升高的趋势。处理3 和处理5，华木莲茎段萌芽率最高，分别为26.50%和28.67%，之间差异不显著，显著高于其它处理，处理3 腋芽萌芽较快，芽粗壮，叶片舒展，切口有较多愈伤组织形成，而处理5 可能6-BA 浓度过高，芽、叶片呈水渍状；其次是处理4，萌芽率为23.67%；萌芽率较低的是处理1 和处理2，萌芽率分别为9.33%和15.28%。在6-BA 浓度不变，华木莲茎段的萌芽率随着IBA 浓度的增加呈现先升后降趋势，处理7 诱导腋芽萌芽率最高，为29.83%，显著高于其它处理，且腋芽萌芽快，芽粗壮，切口愈伤组织较多。因此，华木莲茎段诱导腋芽萌芽最适激素配比为MS +1.5mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L IBA。

继代培养结果表明，华木莲难以诱导芽的增殖（图3），可能与自身的遗传因素有关。

表3 激素配比对华木莲茎段诱导培养的影响

3 讨论与结论

图3 华木莲茎段继代培养的影响

组织培养具有操作简单、繁殖系数高、脱毒、可周年生产等优点，可以在短期内获得大规模苗木，满足市场需求，是木本植物快速、高效无性繁殖的主要方式。影响植物组织培养的因素较多，如基因型、取材时间、消毒时间、培养基、激素等。外植体消毒时间太短，外植体消毒不干净，污染率高；消毒时间太长，污染率低，但对外植体杀伤力大，褐化严重。本研究结果表明，华木莲半木质化茎段组织培养消毒最佳时间为7min，褐化率低，存活率和萌芽率达到最大值，分别为31.25%和20.63%。

植物组织培养采用较多的基本培养基是MS、White、DCR 等培养基，根据研究目的的不同进行调整。吴金寿[3]等研究表明，樟树茎段接入不同培养基培养，以改良MS 为基本培养基的组合诱导不定芽数量最多，苗况较好未见褐变；而以MS 为基本培养基的组合有褐变现象；以1/2MS 为基本培养基的组合不定芽诱导系数最低，且茎叶变为枣红色。吴幼媚[4]等在MS培养基中加入Ca（NO3）2，能够较好地诱导初始芽的形成，减轻芽的褐化程度，促进芽正常生长。本研究结果表明，华木莲茎段组织培养采用MS 培养基褐化率低于DCR 培养基，存活率、愈伤率和萌芽率高于DCR 培养基，且采用MS 培养基，茎段容易诱导产生愈伤组织，腋芽萌芽也较快。因此，华木莲茎段组织培养适宜基本培养基为MS 培养基。

外源激素是植物组织培养成功的关键因子，在外植体的诱导、不定芽的分化与增值及芽苗生根培养过程中，外源激素发挥重要的作用。长期以来，对激素的研究一直停留在凭经验摸索的基础上，对于同一植物，所用激素种类和浓度说法不一。BA、NAA 和IBA 是植物组织培养中应用最广的激素。辜夕容[5]等研究表明高浓度的6-BA 对香樟茎段上隐芽的萌动与伸长有利，而低浓度6-BA 有利于愈伤组织的生长；NAA 浓度越高，香樟茎段上愈伤组织长得越好，但过低或过高则不利于香樟茎段隐芽的萌动与伸长，NAA 为0.05mg/L时，腋芽才长得最好；同时6-BA 与NAA 的比值对香樟茎段上隐芽的萌动与伸长及愈伤组织的生长有较大影响，6-BA/NAA 为40 时，萌出的腋芽最长，较低配比则有利于促进愈伤组织的形成。本研究结果表明，诱导华木莲茎段腋芽萌芽的适宜激素配比MS+1.5mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L IBA，腋芽萌芽较快，芽粗壮，叶片舒展，切口有较多愈伤组织形成。华木莲芽的继代培养难以增殖，可能是因为华木莲在遗传存在严重退化，这与龙桂根等[6]、刘素梅等[7]研究一致。