过氧化物酶体增殖物激活受体—γ激动剂对急性胰腺炎大鼠肺损伤的保护机制研究

陆贝　于源泉　殷俊杰　蔡阳

[摘要] 目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-γ激动剂对胰腺炎大鼠肺损伤的保护作用及调节机制。 方法 72只大鼠随机分为假手术组、模型组和罗格列酮组，各组再分为术后6 h、12 h、24 h组。模型组采用两次腹腔注射L-精氨酸制备SAP模型，罗格列酮组术后30 min静脉注射10%罗格列酮6 mg/kg，假手术组腹腔注射等体积生理盐水。观察大鼠肺病理改变，测定肺TLR4、NF-κB、肺髓过氧化物酶活性、肺干/湿重比、血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量。使用重复测量方差分析，SNK-q检验比较差异。 结果 ROSI组大鼠肺组织病理损害较SAP组减轻；与SAP组比较，肺内NF-κB、TLR4蛋白下降（P<0.05），髓过氧化物酶活性及肺干/湿重比降低（P<0.05）；ROSI组外周血IL-1β、IL-6、TNF-α含量与SAP组比较明显下降（P<0.05）。 结论 PPAR-γ激动剂能减轻急性胰腺炎大鼠肺组织的损伤，抑制NF-κB、TLR4表达，降低促炎细胞因子水平，推测PPAR-γ激动剂对NF-κB/TLR4通路的调节可能是胰腺炎的保护机制之一。

[关键词] 急性胰腺炎；过氧化物酶体增殖物激活受体；核转录因子-κB；Toll样受体

[中图分类号] R576 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）18-0038-04

Protection of PPAR-γ agonists on lung injury in rats with acute pancreatitis

LU Bei1 YU Yuanquan2 YIN Junjie1 CAI Yang1

1.Department of HPB Surgery， Hangzhou First Peoples Hospital， Hangzhou 310006， China； 2.Department of HPB Surgery， the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou 310009， China

[Abstract] Objective To find the protection of PPAR-γ agonists on injured lung cells in rats and mechanism during acute pancreatitis. Methods Rats were divided randomly into three groups： sham operation group， SAP model group， rosiglitazone group. Each group was divided into 6 h， 12 h， and 24 h group after operation. SAP rats model were made via twice peritoneal injection of L-arginine. Rats in ROSI group were injected with 6 mg/kg of 10% rosiglitazone via femoral vein 30 min after operation. Sham operation group rats were peritoneally injected of same volume NS as SAP group. Pathological changes of lung tissue， TLR4， NF-κB， MPO， dry and wet ratio in lung tissue were tested. Serum TNF-α， interieukin-1β， interieukin-6 were also determined. Results The pathological injuries of lung cell were relieved in ROSI group compared with SAP group. There were statistic differences in TLR4， NF-κB， MPO， dry and wet ratio in lung between ROSI and SAP group， which were decreased in ROSI group compared with SAP group（P<0.05）. TNF-α， IL-1β， IL-6 were decreased in ROSI group compared with those in SAP group（P<0.05）. Conclusion The lung tissue injury during SAP may relived by PPAR-γ agonists， and also decrease NF-kappa B， TLR4 and inflammatory cytokines. The probable reason is that PPAR-γ agonists protect pancreas by adjusting NF-κB/TLR4 signal pathway.

[Key words] Severe acute pancreatitis； Peroxisome proliferator activating receptor； Nuclear factor-kappa B； Toll-like receptor

由重癥急性胰腺炎引发的胰外损害中急性肺损伤较为常见，严重者可发生呼吸衰竭甚至死亡。胰腺连锁炎症反应与核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）关系密切，其中过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferators-activated receptor-γ，PPAR-γ）激动剂如罗格列酮可能与NF-κB活化抑制以及AP进展有关。本研究证明罗格列酮能减轻SAP大鼠肺损害，其机制可能与NF-κB/TLR4相关。

1 材料与方法

1.1实验材料

选择72只SD大鼠，体质量269.7～320.4 g（浙江省中医药大学实验动物中心提供）。戊巴比妥钠、L-精氨酸针（Sigma，USA），罗格列酮（Cayman，USA），NF-κB、TLR4抗体（Santa Cruz，USA）、MPO等ELISA试剂盒购自R&D公司（R&D，USA）。

1.2 方法

1.2.1 建模与分组 大鼠随机平均分为三组：模型组（SAP组）、罗格列酮组（ROSI组）、假手术组（SO组）（n=24），术后每组再随机平均分为三组：6 h、12 h、24 h组（n=8）。2.5%戊巴比妥钠0.2 mL/100 g腹腔内注射麻醉成功。SAP组：腹腔内注射浓度为20 g/L的L-精氨酸两次，间隔1 h，每次2.0 g/kg，制模成功。SO组：腹腔内注射等体积生理盐水两次，间隔1 h。ROSI组：术后30 min股静脉注射10%罗格列酮溶液6 mg/kg。

1.2.2 肺组织病理 取右肺前叶HE染色制备组织切片。

1.2.3 肺TLR4、NF-κB检测 取右肺中叶参照试剂盒说明书检测TLR4、NF-κB。结果判定：光镜下随机取5个视野，阳性单位（positive unit）=阳性细胞平均光密度×阳性细胞面积比[3]。

1.2.4 肺髓过氧化物酶活性 取右肺后叶组织，制成组织匀浆后用酶联免疫吸附试验检测MPO活性，具体操作参照MPO ELISA试剂盒说明书。

1.2.5 肺含水量（干/湿重比） 取左肺叶组织，去除脂肪，滤纸吸干表面液体，置电子天平称量左肺湿重。置80℃烤箱干燥48 h，称量干重，计算肺组织干/湿重比。

1.2.6 细胞因子检测 心脏采血后，用ELISA试剂盒测定血清肿瘤坏死因子及白细胞介素1β、白介素6的含量。

1.3 統计学方法

使用SPSS16.0统计学软件分析，用SNK-q检验及重复测量方差分析比较结果。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理变化

SO组肺组织病理无明显改变，见封三图3；SAP组肺组织肉眼可见明显点状出血斑，光镜下肺间质、肺泡、气管出血，间质及血管内中性粒细胞浸润明显，肺泡隔增宽，肺泡破裂、塌陷，见封三图4。与SAP组相比，ROSI组给药12 h后病理改变程度减轻，见封三图5。

2.2 肺组织TLR4、NF-κB比较

SAP组肺泡上皮细胞TLR4、NF-κBp65比SO组升高明显（P<0.05）。ROSI组比SAP组降低明显（P<0.05），见表1。

2.3 肺髓过氧化物酶活性

SAP组肺组织MPO活性较SO组明显升高（P<0.05），ROSI组MPO活性不同程度低于SAP组（P<0.05），差异有统计学意义，见表2。

2.4 各组肺干/湿重比（含水量）比较

SAP组肺脏干/湿重比较SO组增高（P<0.05），并随时间延长逐渐递增，ROSI组干/湿重比与SAP组比较有统计学差异（P<0.05）（除6 h），见表3。

2.5 各组血清炎症细胞因子比较

SAP组、ROSI组TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子均有不同程度升高，但两组比较差异有统计学意义（P<0.05）（除6 h），见表4。

3讨论

重症急性胰腺炎除自身的出血坏死以外，早期胰外器官损伤中急性肺损伤（acute lung injury，ALI）的比例超过50%，早期因呼吸衰竭死亡患者比例高达60%[1-2]。但SAP引起ALI的具体机制比较复杂，可能与中性粒细胞、巨噬细胞、肥大细胞等炎症反应细胞有关，或者与TNF-α、IL等炎症因子和趋化因子的作用有关，也可能与血小板活化因子、核因子-κB、基质金属蛋白酶等有关。核转录因子-κB控制多种炎症因子，如TNF-α、IL-6、IL-8的表达，介导多种组织细胞凋亡，过度表达可对胰腺及胰外组织细胞造成不可逆损伤，因此被认为是SAP炎症级联瀑布反应的上游靶点。抑制NF-κB活化后，胰腺及胰外器官的损害减轻，炎症细胞因子含量降低[3-9]。Jiang C等[10]在上世纪末第一次证实PPAR-γ激动剂对炎症细胞因子有调节作用，具体与NF-κB基因表达抑制和细胞因子降低密切相关。Hashimoto等[11]通过对AP大鼠注射PPAR-γ激动剂，证实能降低NF-κB活性，首次在动物层面证明PPAR-γ激动剂对AP治疗有效。大多数实验研究表明抑制NF-κB对AP有利，但同时也可能加重AP，并且该双重作用可能与抑制剂的剂量相关，当大剂量使用NF-κB抑制剂时，细胞凋亡过程被同时阻断，导致组织损伤加重[12]。

本实验中SAP组大鼠肺组织有明显的急性损伤病理改变，ROSI组大鼠在SAP造模后30 min通过股静脉注射10%罗格列酮，大体及镜下肺病理损伤有减轻，肺组织NF-κB、TLR4活性下降，外周血IL-1β、IL-6、TNF-α下调，肺组织MPO活性及肺含水量（干/湿重比）下降，对比差异有统计学意义，罗格列酮的抑制作用与其他学者研究结果一致，并且罗格列酮的作用机制与NF-κB/TLR4通路相关，降低外周血细胞因子水平，减轻胰腺炎造成的肺损害。

罗格列酮是高选择性PPAR-γ激动剂，已广泛投入临床用于治疗糖尿病等疾病，同时它也发挥着独特的抗炎作用[13-22]。裴红红等[23]发现罗格列酮能抑制NF-κB表达，减轻AP大鼠胰腺损伤，罗格列酮抑制剂可加重胰腺损伤，NF-κB表达增加。Ivashchenko等[24]对去除PPAR-γ表达的AP大鼠注射罗格列酮，发现其保护作用减弱明显，间接证实PPAR-γ在AP过程中的重要作用。本研究进一步证实罗格列酮对AP大鼠的肺损伤有保护作用，NF-κB/TLR4通路与此过程密切相关，抑制NF-κB/TLR4通路能调控炎症反应，减轻组织器官损伤，希望不久的将来能为SAP肺损伤患者提供确切的治疗。

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（收稿日期：2017-02-24）