木瓜黄精膏对衰老模型小鼠肾细胞凋亡的影响

郭芙莲

（漯河医学高等专科学校，河南漯河462002）

木瓜黄精膏对衰老模型小鼠肾细胞凋亡的影响

郭芙莲

（漯河医学高等专科学校，河南漯河462002）

目的探讨木瓜黄精膏（PRO）对衰老模型小鼠组织匀浆中MDA含量、SOD活性以及肾细胞凋亡和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响。方法注射D-半乳糖造模，同时给予不同剂量的PRO，采用DNA末端标记法（TUNEL）以及免疫组化SP法观察肾细胞凋亡与肾脏Bax和Bcl-2表达水平。结果40日后，PRO可显著提高小鼠组织匀浆中SOD活性，显著降低MDA含量，与衰老模型组相比有显著性差异（P＜0.01）。PRO组肾脏细胞凋亡率明显下降（P＜0.05或P＜0.01），Bcl-2表达增强，Bax表达及Bax/Bcl-2比值下调（P＜0.05或P＜0.01），尤以PRO大、中剂量组作用显著。结论PRO具有较好的体内抗氧化作用。

木瓜黄精膏；抗氧化；SOD；MDA；Bax；Bcl-2

目前，我国已进入老龄化社会，截至2014年底，60岁以上老年人口达到2.1亿，占全国总人口的15.5%，在这些老年人口中有将近4 000万人失能、半失能。据有关部门预测，到2035年，我国的老年人口将达到4亿。随着老龄化的不断加剧，人们越来越关心如何应对衰老以及怎样延缓衰老。细胞的生理状态和化学反应发生复杂变化导致衰老，最终影响到其形态、结构和功能。生物体内绝大多数细胞都会经历未分化、分化、衰老、死亡几个阶段，衰老是一种正常生命现象。关于细胞衰老的原因，自由基学说认为：攻击DNA引起基因突变或攻击蛋白质引起蛋白质活性降低，从而导致组织器官功能衰退，机体进入衰老状态。细胞死亡受细胞内某种由遗传机制决定的“死亡程序”控制，称为细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD），又称细胞凋亡。衰老就是细胞凋亡的过程，因此，抑制或减少衰老机体中细胞过度凋亡，可能有助于减缓机体衰老的发生和发展[1]。Bcl-2家族是细胞凋亡相关基因。Bcl-2是一种原癌基因，能够抑制细胞凋亡并延长细胞生存时间。Bcl-2家族成员的基因中，常含有3个保守的Bcl-2同源区，是调节细胞凋亡及蛋白质相互作用所必需的。Bax是凋亡促进剂，Bcl-2是凋亡抑制剂，因此，检测细胞中Bax、Bcl-2表达，可以判断细胞凋亡的情况。研究表明，木瓜黄精膏（PRO）可以降低衰老模型小鼠血清及组织匀浆中MDA含量、提高SOD活性[2，3]。本实验进一步观察PRO对衰老模型小鼠肾细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响，观察其抗氧化功能并探讨其作用机理，为解决衰老问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明种小白鼠60只，2月龄，雌雄各半，体重（22±3）g，由郑州大学实验动物中心提供。

1.2 中药及制备

所需中药材均购自郑州市药材公司，由我校生药教研室鉴定。由漯河市中医院制剂室将木瓜、黄精、大枣、荷叶按比例制成生理盐水混悬液后进行分装，分别浓缩成生药浓度5 g/m l，3 g/ml，2.5 g/m l。将配制好的药液高压灭菌，4℃冰箱保存。

1.3 主要试剂

D-半乳糖（上海试剂二厂）；原位缺口末端标记法（Tdtmediated d-UTP-biotin nick end labeling，TUNEL）细胞凋亡试剂盒（MK1020）、兔抗Bax和Bcl-2多克隆抗体及SP法二抗试剂盒（SA2015，SA1022），由武汉博士德生物工程有限公司提供；其余试剂均为分析纯。

1.4 仪器

721-分光光度计（上海第三分析仪器厂），GL6-HPIAS高清晰度彩色病理图文分析系统（东方德公司），小型高速离心机（美国ThermoMicroMax CL17），常温冰箱（新乡BCD－312KA），电子天平（梅特勒AL10401），超低温冰箱（美国ThermoForma702），超纯水仪（美国Milli-QAcademic），移液器（法国GILSON）。

1.5 实验方法

1.5.1 分组及给药将小白鼠置于（23±2）℃的动物室中自由进食水喂养7日后随机分为5组，即空白对照组、衰老模型组、PRO大剂量组、PRO中剂量组、PRO小剂量组，每组12只。空白对照组颈后皮下注射0.5m l生理盐水，其余各组皮下注射5%D-半乳糖0.5m l，每日1次，连用4周。造模成功后，空白对照组和衰老模型组每只每天灌胃等容积生理盐水，PRO大剂量组按30.0 g/kg·d剂量灌胃，PRO中剂量组按15.0 g/kg·d剂量灌胃，PRO小剂量组按7.5 g/kg·d剂量灌胃。连续给药40天。

1.5.2 标本制备40天后将小白鼠处死，取各器官组织0.2 g制成10 g/100 ml的组织匀浆，4 000 r/min离心后取上清液待测。制作组织匀浆的同时将肾脏固定、脱水、石蜡包埋，检测肾细胞凋亡及肾脏Bcl-2和Bax表达水平。

1.5.3 肾细胞凋亡检测按试剂盒说明书进行肾组织石蜡切片，脱蜡入水，荧光素标记，之后用结合了过氧化物酶（POD）的抗荧光素抗体与荧光素结合，再与底物DAB进行显色反应，苏木素复染，常规脱水、透明、中性树胶封片。胞核出现棕黄色颗粒的细胞为凋亡细胞。统计肾脏凋亡细胞数量，每组制作8张切片，在光镜（400倍）下计数每张切片8个连续不重叠视野中的阳性细胞数，计算每100个细胞中平均阳性凋亡细胞数，即凋亡指数（Apoptosis Index，AI）。

1.5.4 免疫组化SP法检测肾组织Bax和Bcl-2表达肾脏去除被膜取皮质，4%中性福尔马林固定、脱水、浸蜡、包埋、切片，厚度4μm，常规脱蜡水洗，一抗为兔抗大鼠Bax或Bcl-2多克隆抗体（1∶50稀释），标本置湿盒内4℃过夜，滴加生物素化羊抗兔二抗IgG（1∶100稀释），滴加辣根过氧化物酶标记链霉素卵白素，DAB显色，镜下控制显色时间，苏木精复染细胞核，常规脱水、透明、中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，以博士德公司提供的扁桃腺切片作为阳性对照。胞质呈棕色颗粒的细胞为阳性表达细胞，光镜观察阳性信号。每组8张切片，每张切片在400倍视野下随机选择5个视野，采用GL6-HPIAS高清晰度彩色病理图文分析系统检测平均吸光度（A值），了解Bax和Bcl-2表达水平。

1.6 统计分析

采用Excel2007录入和管理数据。数据资料用均值±标准差（±s）表示，用SPSS 19.0软件统计分析，实验结果用χ2检验。

2 结果

（1）PRO对衰老模型小鼠组织匀浆MDA及SOD的影响与相关研究一致[3]，衰老模型组与空白对照组比较，小鼠组织匀浆中MDA含量均显著升高，SOD含量均减少，造模成功。

（2）PRO对衰老模型小鼠肾细胞凋亡的影响。光镜下可见凋亡细胞胞核呈棕色或棕黑色，胞核略小或呈碎片状，而正常细胞和坏死细胞的胞核则由苏木素染蓝紫色。本实验中，空白对照组与PRO组小鼠细胞核大而清晰，大小一致，只偶见染棕褐色细胞；衰老模型组可见较多散在且大小不一的棕褐色胞核，分布于肾小管的多于肾小球；PRO大、中剂量组只见到少量棕褐色颗粒；PRO小剂量组棕褐色阳染颗粒数量与衰老模型组接近。PRO组凋亡指数显著低于衰老模型组（P＜0.05或P＜0.01），尤以PRO大、中剂量组为著（见表1）。

表1 PRO对衰老模型小鼠肾细胞凋亡的影响（±s）

表1 PRO对衰老模型小鼠肾细胞凋亡的影响（±s）

注：与空白对照组比较，△P＜0.01；与衰老模型组比较,*P＜0.05，**P＜0.01

组别剂量0.5ml/只0.5ml/只7.5 g/kg·d 15.0 g/kg·d 30.0 g/kg·d凋亡指数0.33±0.14 6.25±2.13△4.82±1.52* 1.13±0.74** 0.52±0.23**空白对照组衰老模型组PRO小剂量组PRO中剂量组PRO大剂量组视野数（个）64 64 64 64 64

（3）PRO对衰老模型组小鼠肾细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的影响。Bcl-2主要在肾小管表达，而Bax在肾小管和肾小球均有表达。二者都定位于胞浆，呈灶性分布，染成棕黄色。与空白对照组比较，衰老模型组Bax表达明显增加，Bcl-2表达较弱，Bax/Bcl-2比值明显升高（P＜0.01）；与衰老模型组比较，PRO组Bcl-2表达明显增强而Bax表达减弱，Bax/Bcl-2比值显著降低（P＜0.05或P＜0.01），见表2。

表2 PRO对衰老模型组小鼠肾脏凋亡相关蛋白表达的影响（±s）

表2 PRO对衰老模型组小鼠肾脏凋亡相关蛋白表达的影响（±s）

注：与空白对照组比较，△P＜0.01；与衰老模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别剂量视野数（个）A值Bax/Bcl-2 Bax Bcl-2空白对照组衰老模型组PRO小剂量组PRO中剂量组PRO大剂量组0.5ml/只0.5m/只7.5g/kg·d 15.0g/kg·d 30.0g/kg·d 40 40 40 40 40 0.12±0.01 1.21±0.61△0.63±0.51* 0.31±0.72** 0.25±0.12** 0.24±0.01 0.13±0.12△0.51±0.32* 1.11±0.81** 1.42±1.25** 0.50±0.11 4.12±0.33△1.72±0.12* 0.83±0.21** 0.71±0.18**

3 讨论

细胞凋亡是细胞的一种生理性调节机制，在控制细胞增殖和分化、肿瘤的发生和生长以及机体免疫调节中起着重要作用，肾小管上皮细胞过度凋亡是急性肾小管坏死中肾功能异常的重要原因之一。损伤较轻时，引起细胞凋亡；损伤较重时，使细胞坏死。如能通过药物干预，减少细胞凋亡，就能使肾小管上皮细胞再生，从而减少该病发生[4]。Bcl-2家族分为抑凋亡基因（如：Bcl-2、Bcl-Xl等）和促凋亡基因（如Bax、Bcl-Xs等）。Bcl-2与Bax的比例是决定细胞凋亡敏感性的变阻器，Bax-Bax同源二聚体促进凋亡，Bcl-2-Bax异源二聚体抑制凋亡[5]。Bcl-2和Bax主要位于线粒体膜外侧，仅用于凋亡的线粒体途径。当凋亡发生时，Bax从胞浆移到线粒体并与线粒体膜结合，形成二聚体，导致线粒体功能紊乱，引起一系列改变：线粒体渗透性改变、氧化磷酸化和ATP合成功能破坏；细胞氧化还原作用改变及线粒体中ced-4同源体APaf-1从线粒体中释放出来，与细胞色素C相互作用，激活Caspase，促进凋亡[6]。研究表明，Bcl-2过量表达能够延长神经细胞生存时间。将表达Bcl-2基因的质粒显微注入神经细胞可防止其凋亡，如用反义RNA降低Bcl-2表达，则加速无生长因子存在时的细胞死亡[7，8]。

木瓜黄精膏由木瓜、黄精、大枣、荷叶四味中药组成，木瓜和胃健脾、美容养颜，富含17种氨基酸及钙、铁等，还含有木瓜蛋白酶、番木瓜碱等。木瓜在中国素有“万寿果”之称，顾名思义，多吃可延年益寿。荷叶活血化瘀，凉血止血，清心解暑，另外还有抗衰老、抗氧化之功效[9]。黄精味甘，性平，补脾益气、滋肾润肺，同时还可抗氧化及延缓衰老[10]。大枣在抗氧化、改善心血管系统及造血功能等方面有着明显作用[11]。与空白对照组比较，衰老模型组小鼠组织匀浆中SOD活性明显降低，MDA含量显著升高。本研究观察到，衰老模型组小鼠肾细胞凋亡相关蛋白Bax表达相对于正常组增高，Bcl-2表达下降、Bax/Bcl-2比例升高，表明衰老模型组细胞凋亡增加。不同剂量PRO均能上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，从而使Bax/Bcl-2比值下降，起到调控肾细胞凋亡的作用。实验结果提示，PRO能明显抑制衰老模型组小鼠肾细胞凋亡，且其延缓衰老作用呈一定的量效关系，高、中剂量组抑制细胞凋亡作用强于低剂量组。综上所述，PRO能通过干预凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2表达抑制肾细胞凋亡从而起到抗衰老作用，是一种具有良好应用前景的抗衰老药物。今后我们还要进一步研究PRO的临床治疗效果和作用机理。

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G424.31

B

1671-1246（2017）13-0088-03

注：本文系河南省教育厅自然科学项目（2009C310008）