转DBN9978基因抗虫抗除草剂玉米对大鼠的亚慢性毒性研究

王 睿，胡贻椿，李 敏，吴景欢，杨晓光，毛德倩

(中国疾病预防控制中心营养与健康所/国家卫计委微量元素营养重点实验室，北京 100050)

转DBN9978基因抗虫抗除草剂玉米对大鼠的亚慢性毒性研究

王 睿，胡贻椿，李 敏，吴景欢，杨晓光，毛德倩

(中国疾病预防控制中心营养与健康所/国家卫计委微量元素营养重点实验室，北京 100050)

目的：研究喂饲转DBN9978基因玉米对大鼠的亚慢性毒性。方法：选用断乳SD大鼠140只，随机分为7组，即3个转基因组(73.3%、36.65%、18.33%)、3个亲本玉米组(72.7%、35.35%、18.18%)、1个常规基础饲料对照组。每组20只，雌雄各半。动物2只/笼喂养，自由进食饮水，连续观察90d。观察大鼠体重、进食量、血液学指标、血生化指标，实验结束后摘取动物脏器进行病理组织学检查。结果：各剂量组动物的体重均呈增长趋势，转基因组、亲本对照组与饲养对照组每周体重及体重总增重、每周进食量、总食物利用率以及中、末期的血液学和血生化指标，各主要脏器系数及病理组织学检查比较，均未发现有生物学意义的改变。结论：现有试验结果不能证实该转DBN9978基因玉米对大鼠有亚慢性毒性作用。

转基因玉米；DBN9978基因；亚慢性毒性

玉米螟和田间杂草是玉米种植中两个重要问题，因此，抗虫和抗除草剂一直是玉米品种改良的重要内容[1]。利用转基因方法可以显著提高玉米抗虫、抗除草剂的品质，具有重要的经济效益，但这种技术是否会对人体带来危害，是社会关注的热点问题。本次实验依据“实质等同性”原则[2]，按照中华人民共和国农业行业标准(NY/T1102-2006)《转基因植物及其产品食用安全检测—大鼠90d喂养试验》[3]，对转DBN9978基因玉米进行了大鼠90 d喂养试验，了解分析该转基因玉米是否会对大鼠产生亚慢性毒性作用，为该转基因玉米的食用饲用性安全提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要仪器

转基因玉米DBN9978，以下简称转基因玉米；转化受体DBN567，以下简称亲本玉米；AIN-93G，以下简称对照玉米(均为黄色籽粒，DBN9978、DBN567，由北京大北农生物技术有限公司提供，经产品检测后开展本次试验)。L535R湘仪低速冷冻离心机、BS-220型全自动生化分析仪、BC-5000VET全自动五分类血液分析仪、Leica HI1220烘片机、Leica RM2016轮转式切片机、Leica HI1210摊片机、Leica EG1150H型石蜡包埋机。血细胞稀释液及溶血剂，购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；血生化检测试剂盒，购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司、重庆中元生物技术有限公司。

1.2 实验动物和饲养条件

北京维通利华实验动物技术有限公司提供的健康SD大鼠(SPF级，许可证号：SCXK(京)2012-0001)。饲养地点：汇智泰康生物技术(北京)有限公司，级别：屏障环境，许可证号：SYXK(京)2014-0022。

1.3 饲料配制

实验开始前在北京市营养源研究所检测中心对各种玉米的营养成分进行全面检测，参照美国营养研究所的AIN-93G配方，在保证营养平衡的基础上以蛋白质最大掺入为原则计算转基因玉米能掺入饲料的最大比例。经计算得出亲本玉米在饲料中的最大掺入量为72.70%，以此作为高剂量，中、低剂量的玉米掺入量分别设为35.35%和18.18%。转基因玉米在饲料中的最大掺入量为73.3%，以此作为高剂量，中、低剂量的玉米掺入量分别设为36.65%和18.33%。以上饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司制备。配制好的饲料辐照灭菌后真空包装保存供实验使用。

1.4 实验方法

选用断乳SD大鼠140只，随机分为7组，即DBN9978低、中、高剂量组(以下简称转高、转中、转低)，亲本玉米DBN567低、中、高剂量组(以下简称亲高、亲中、亲低)，AIN-93G(以下简称对照)。每组20只，雌雄各半。动物2只/笼喂养，自由饮食，每周称量1次大鼠体重，每周记录1次给食量和剩食量，连续观察90d。各组于实验中期和实验结束分别采血测各项血液学、血生化指标，实验结束后摘取动物脏器进行病理组织学检查。

1.5 观察指标

1.5.1 大鼠生长发育情况 每天观察大鼠的一般表现、外观、毒性表现及死亡情况，每周称量1次大鼠体重，每周记录1次给食量和剩食量，计算食物利用率。

1.5.2 血液学检查 试验中期和试验结束时进行血液学指标测定。测定指标为白细胞计数WBC及其分类(Neu%、Lym%、Mon%)、红细胞计数RBC、血红蛋白HGB、血小板计数PLT。试验中期大鼠眼内眦取血，试验结束大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉采血。

1.5.3 临床生化学检查 试验中期和试验结束时进行血液生化指标测定，空腹采血。测定指标为丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、尿素氮(UREA)、肌酐(CREA)、血糖(GLU)、血清白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、总蛋白(TP)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)。

1.5.4 脏体比 实验结束处死动物取肝、肾、肾上腺、脾、胸腺、心脏、睾丸称重，计算相应的脏体比。

1.5.5 病理组织学 解剖观察及组织病理学检查。

1.6 统计方法

转基因玉米DBN9978低、中、高剂量组与相应剂量的转化受体DBN567组和AIN-93G对照组比较，采用SPSS统计软件进行单因素方差分析(ANOVA)，方差齐时采用Bonferroni检验，方差不齐采用Games-Howell检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 生长状况及食物利用率

实验期间对照组中有1只雌性动物在第9w意外死亡，大体解剖脏器未见异常，该组其他动物以及其余各组动物在整个实验期间活动、生长正常，被毛浓密有光泽。大鼠体重(表1)。雄性、雌性大鼠转基因各剂量组与相应剂量的亲本组相比较，体重未见明显差异。雄性转低组总进食量高于亲低组，其余各剂量组雌、雄动物的总增重、总进食量以及总食物利用率未见显著差异(表2)。与对照组相比，雄性大鼠转基因三个剂量组和亲中组的总增重高于对照组。雄性大鼠转基因3个剂量组和亲本对照3个剂量组总进食量均高于对照组；雌性大鼠转基因3个剂量组和亲中组总进食量均高于对照组，雌、雄大鼠总食物利用率在各玉米掺饲剂量组和对照组之间未见显著差异(表2)。

表1 受试物90d喂养实验对大鼠体重的影响

注：a与对照组比较，P<0.05.

2.2 血液学指标

实验末期，亲高组1只雌性动物样本出现凝血，对照组中1只雌性动物在第9周意外死亡，检测结果未纳入数据统计。由表3～4可见，试验中期与试验末期有个别指标出现统计学差异，但均在该品系动物正常值范围内[9-10]。其余各组各指标与对照组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)，转基因其余各组各项指标与其相应剂量的亲本对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.3 血生化指标

由表5～6可见，试验中期与试验末期转基因组和亲本组有个别指标与对照组差异有统计学意义，但无剂量-反应关系且变化均在该品系动物正常值范围内[7-8,10]。

表2 受试物90d喂养试验对大鼠总增重、总进食量和总食物利用率的影响±SD)

注：a与对照组比较，P<0.05；b与相应剂量的亲本对照组比较，P<0.05。

表3 受试物90d喂养试验对大鼠中期血液学的影响±SD)

注：a与对照组比较，P<0.05；b与相应剂量的亲本对照组比较，P<0.05。

表4 受试物90d喂养实验对大鼠末期血液学的影响±SD)

注：a表示与对照组比较，P<0.05；b表示与相应剂量的亲本对照组比较，P<0.05。

表5 受试物90d喂养试验对大鼠中期血生化指标的影响±SD)

注：a与对照组比较，P<0.05；b与相应剂量的亲本对照组比较，P<0.05。

表6 受试物90d喂养实验对大鼠末期血生化指标的影响±SD)

(续)

注：a与对照组比较，P<0.05；b与相应剂量的亲本对照组比较，P<0.05。

2.4 大鼠脏体比

试验末期对个剂量组的脏器重量称重，并计算脏体比。雄性大鼠亲高、亲中、亲低、转高及转中组动物的肾脏脏体比显著降低(P<0.05)；雌性大鼠亲低、转中及转低组动物的肝脏脏体比显著降低(P<0.05)，转高及转低组动物的肾脏脏体比显著降低(P<0.05)。其余各组大鼠脏体比与对照组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)。转基因各剂量组脏体比与相应亲本组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)(表7)。

表7 受试物90d喂养实验对大鼠脏体比的影响

注：a与对照组比较，P<0.05

2.5 大体病理及组织学检查

各组大鼠外观、皮肤未见异常，胸、腹腔膜未见出血点、积液，主要脏器正常，未见明显病理病变。对转基因玉米、亲本玉米以及AIN93G对照组SD大鼠脑、心、肺、肾、肝、肾上腺、脾、胃肠(十二指肠、空肠和回肠)、胸腺、甲状腺、睾丸、附睾、前列腺、卵巢及子宫进行了病理组织学检查，未见与受试物有关的特异性毒性病理改变。

3 讨论

1986年首批转基因植物被批准进入田间试验，至今国际上已有30个国家批准数千例转基因植物进入田间试验，涉及的植物种类有40多种，全球转基因作物种植面积达4 420万hm2。1994年转基因番茄在美国批准上市，2015年1月13日，欧洲议会全体会议通过一项法令，允许欧盟成员国根据各自情况选择批准、禁止或限制在本国种植转基因作物[4]。在转基因作物给人们带来惊喜和美好憧憬的同时，其食用安全性也引起世人关注，其焦点问题主要是转基因作物是否会危害人类和动物的健康及破坏生态环境。

目前，世界各国普遍把大鼠90d喂养实验作为评价转基因全食品毒性的主要内容，用以观察动物生长过程中的亚慢性毒性表现。1993年，OECD提出了“实质等同性”的概念[5]，目前67个国家把这一原则作为评价转基因食品安全性的最有效的途径和最基本原则[6].本实验正是依照此原则，参照美国营养研究所的AIN-93G配方，在保证营养平衡的基础上以蛋白质最大掺入为原则计算转基因玉米能掺入饲料的最大比例，设置了两个对照组，亲本玉米组和AIN93 对照组，前者用来发现转入的外源基因可能带来的影响，后者用来排除玉米自身成分对实验可能造成的影响。

本研究以掺入比例为18.83%、36.65%、73.3%的转基因玉米DBN9978及其亲本玉米掺入饲料给予大鼠90d，结果发现，雄性、雌性大鼠转基因玉米各剂量组与相应剂量的亲本对照玉米组相比较，体重、体重增长、周摄食量、对周食物利用度虽有个别统计学意义上的显著性差异，但在历史对照数据范围内，且总体重增加、总进食量和总食物利用率未见显著差异；此外转基因玉米各剂量组与其相应剂量的亲本对照相比较，脏器重量和脏体比均无显著性差异(P>0.05)。实验中期和末期各项血液学指标和血生化指标结果显示，转基因玉米各剂量组与相应剂量的亲本对照玉米组相比较，有个别指标有统计学差异，但大部分有差异的指标没有同时与两个对照组都存在差异或没有同时在雌雄大鼠中存在差异，且基本上都在文献报道的正常范围之内[7-10]，且未出现剂量-效应关系。实验末期对7组SD大鼠脑、心、肺、肾、肝、肾上腺、脾、胃肠(十二指肠、空肠和回肠)、胸腺、甲状腺、睾丸、附睾、前列腺、卵巢及子宫进行了病理组织学检查，未见与受试物有关的特异性毒性病理改变。此外，动物实验中会受转基因食品特性外的一些不确定因素的影响[11]，因此认为，这些差异有可能与大鼠个体差异有关，而以不应认为指标升高是因饲喂转基因饲料造成的。

综上所述，本实验结果未发现具有对大鼠有生物学意义的亚慢性毒性作用。本研究还将开展急性毒性实验、多代繁殖实验、营养功效等方面的研究，更好地评价该转基因玉米的食用安全性。◇

[1]张力，王静，姜淑卿，等. 转Cry1Ab/Cry2Aj 和G10evo(EPSPS)基因抗虫耐草甘膦玉米对大鼠的亚慢性毒性研究[J]. 环境与健康杂志，2016，33(7)：585-589

[2]WHO.Application of the principles of substantial equivalence to the safety evaluation of food components from plants derived by modern biotechnolog[R].Geneva：WHO，1995：11.

[3]中华人民共和国农业行业标准，转基因植物及其产品食用安全检测——大鼠90d 喂养试验[S]. 北京：中华人民共和国农业部，2006.

[4]王琴芳，薛爱红，大昉.转基因植物产业化现状与发展趋势[J]. 中国农业科技报，2000，2(2)：33-36

[5]WHO.Application of the principles of substantial equivalence to the safety evaluation of food components from plants derived by modern biotechnology[R].Geneva：WHO，1995：11.

[6]农业部.农业转基因生物安全评价指南[S].2006：6.

[7]齐云，蔡润兰，刘彬，等.新药长毒试验动物血液生化测定规范化研究系列之五[J].中国比较医学杂志，2006，16(4)：193-196.

[8]朱华，高虹，黄澜，等.清洁级SD大鼠标准生物学指标的建立[J].医学动物防制，2005，21(9)：629-633

[9]田辉，樊柏林. SPF 级Wistar大鼠血液学及生化指标正常值范围探讨[J].实验动物科学，2007，24(2)：23-24

[10]蒋中仁,徐薇,金伟，等.SD大鼠血液学指标、血生化指标及脏体比正常值范围探讨[J].预防医学情报杂志，2011，27(10)：789-791.

[11]Keiko M，Wataru H，Hye-Jin Y，et al.Safety assessment of riegenetically modified with soybean glycinin by feeding studies on rats[J].Biosci Biotechnol Biochem，2000，64(9)：1881-1886

(责任编辑 李婷婷)

Subchronic Toxicity Test of Genetic Modified Corn with DBN9978 Gene in Rats

WANG Rui，HU Yi-chun，LI Min，WU Jing-huan，YANG Xiao-guang，MAO De-qian

(National Institute for Nutrition andHealth，Chinese Center for Disease Control and Prevention/Key Laboratory of Trace Element Nutrition，National Health and Family Planning Commission，Beijing 100050，China)

ObjectiveThe subchronic toxicity of feed withDBN9978 genetic modified corn was tested in rats.Method A total of 140 SD rats were randomly divided into 7 groups with 20 rats each group including three transgenic corn groups with different doses (73.3%，36.65%，18.33%)，three containing non-transgenic corn (72.7%，35.35%，18.18%)，1 routine Basal diet control group. Animals 2/cage feeding，free to eat drinking water，continuous observation of 90 days. Observation of body weight，food intake，the blood routine test，blood biochemistry test (at the 45 th day and the 90 th day of the experiment)，organ weight and organ pathological examination (at the end of the 90 th day)were conducted. Result The weight of the animals in each dose group showed an increasing trend. The weight and weight gain，weekly food intake，total food utilization rate and blood and blood biochemical indexes of the transgenic corn groups，containing non-transgenic corn group and the feeding control group，The main organ coefficient and histopathological examination were found no significant changes in biological significance.Conclusion There were no enough evidences to confirm GM corn withDBN9978 genes has subchronic toxic effects on rat.

genetically modified corn；DBN9978 gene；subchronic toxicity

国家科技重大专项——转基因生物新品种培育“抗虫抗除草剂转基因玉米食品安全评价研究”。

王 睿(1984— )，女，硕士，助理研究员。研究方向：营养素需要量。

毛德倩(1974— )，男，硕士，副研究员，研究方向：营养学。