SRT1720对高糖诱导的小鼠系膜细胞凋亡的影响

刘 静，张 瑞，李冠青，史永红,3

(1.河北医科大学病理学教研室，河北 石家庄 050017;2.开滦总医院肾内科，河北 唐山 063000;3.河北省肾脏病重点实验室，河北 石家庄 050017)

SRT1720对高糖诱导的小鼠系膜细胞凋亡的影响

刘 静1,2，张 瑞1，李冠青1，史永红1,3

(1.河北医科大学病理学教研室，河北 石家庄 050017;2.开滦总医院肾内科，河北 唐山 063000;3.河北省肾脏病重点实验室，河北 石家庄 050017)

目的 观察Sirt1激活剂SRT1720对高糖诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡的作用。方法 体外培养小鼠肾小球系膜细胞，随机分为正常糖组、正常糖+甘露醇组、高糖组及高糖+SRT1720组。采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)及流式细胞术检测细胞凋亡；流式细胞术检测活性氧簇(ROS)产生；Western blot检测caspase-3、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、p38 MAPK、p-p38 MAPK、Sirt1、p53、乙酰化p53及细胞色素C的表达；实时定量PCR检测Bax和Bcl-2 mRNA的表达。结果 与正常糖对照组相比，高糖组系膜细胞ROS产生和细胞凋亡明显增加，cleaved caspase-3、p-p38 MAPK和乙酰化p53表达增高、Bax/Bcl-2比率明显升高、Sirt1表达下降以及细胞色素C易位。SRT1720干预能够明显抑制高糖诱导的系膜细胞凋亡和ROS产生；下调cleaved caspase-3、乙酰化p53和p-p38 MAPK的表达；上调Sirt1的表达；减少Bax/Bcl-2比率和细胞色素C 易位。结论 SRT1720能够抑制高糖诱导的系膜细胞凋亡，可能是通过减少ROS产生、保护线粒体功能、抑制p53乙酰化以及p38MAPK信号通路激活而实现的。

SRT1720；小鼠肾小球系膜细胞；凋亡；氧化应激；沉默信息调节因子2 相关酶1；p53

随着人均寿命的延长和生活习惯的改变，糖尿病(diabetes mellitus, DM)发病率逐年增加。糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见的微血管并发症。肾小球系膜细胞的凋亡在DN发病过程中发挥重要作用，其造成的系膜细胞缺失是导致糖尿病肾损伤的重要机制之一[1-2]。高糖(high glucose, HG)可通过诱导活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的产生，促进肾小球系膜细胞凋亡[1]。我们的前期研究表明，抗氧化肽SS-31能够明显抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞ROS产生以及细胞凋亡[3]。研究表明，肾脏特异性过表达沉默信息调节因子2 相关酶1 (silent mating type information regulation 2 homolog 1，Sirt1)能够抑制顺铂引起的肾脏ROS产生[4]。Sirt1激活剂白藜芦醇能够抑制糖尿病肾脏细胞氧化应激以及细胞凋亡[5]。SRT1720是一种Sirt1的激活剂，其在体内的代谢时间比白藜芦醇更长,它与Sirt1 之间的结合能力是白藜芦醇的1 000倍左右[6]。研究表明，SRT1720对缺血/再灌注引起的肾脏细胞凋亡具有明显保护作用[7]。然而，SRT1720对HG诱导的肾小球系膜细胞凋亡的作用，还未见报道。本实验旨在探讨SRT1720对HG诱导的小鼠肾小球系膜细胞凋亡的作用以及相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠系膜细胞(CRL-1927)来自美国菌种保藏中心(Manassas, VA)。D-glucose和Mannitol为Sigma公司产品；兔抗caspase-3、cleaved caspase-3、p38 MAPK和p-p38 MAPK为美国Cell Signaling公司产品；兔抗Sirt1、Bax、Bcl-2、p53、acetylated p53和细胞色素C抗体购自英国Abcam公司；TUNEL试剂盒为美国Promega公司产品；SRT1720购自美国Selleckchem公司；辣根酶标记羊抗兔IgG购自北京中杉金桥公司；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)为美国Millipore公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组刺激实验 以含5%胎牛血清、2 mmol·L-1L-谷氨酰胺、100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的DMEM-F12(3 ∶1)培养基，5% CO2、37℃培养箱中常规培养细胞。待MMCs达75%～85%融合后，用无血清培养基同步24 h。将细胞分成4组： 正常糖组(5.6 mmol·L-1葡萄糖，NG)、正常糖+甘露醇组(5.6 mmol·L-1葡萄糖+24.4 mmol·L-1甘露醇,M)、高糖组(30 mmol·L-1葡萄糖，HG)、高糖+SRT1720组(30 mmol·L-1葡萄糖+10 μmol·L-1SRT1720, HG+SRT)。于刺激的不同时间收集细胞，进行以下观察。

1.2.2 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡 收集上清及贴壁细胞，用PBS洗2次，用体积分数0.70的乙醇4℃固定24 h，PBS洗2次，碘化丙啶避光染色30 min，流式细胞仪观察。

1.2.3 末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口标记法(TUNEL)检测细胞凋亡 MMCs接种于8孔Lab-Tek®腔室玻片(美国Nalge Nunc公司)上，分组刺激48 h。根据说明书使用DeadEndTM荧光TUNEL系统检测细胞凋亡。荧光显微镜下计数每个高倍视野中阳性染色细胞数和总细胞数，计算阳性细胞百分比。

1.2.4 Western blot检测 细胞用冰冷PBS洗2遍，加入细胞裂解液(25 mmol·L-1Tris-HCl, 10 mmol·L-1EDTA，体积分数0.01 NP-40，150 mmol·L-1氯化钠，质量浓度1 g·L-1苯甲基磺酰氟), 冰浴1 h，4 ℃、14 000 r·min-1离心25 min，Lowry法测定上清液蛋白浓度。分离线粒体和不含线粒体的胞质蛋白。不含线粒体的胞质蛋白用于检测细胞色素C。细胞裂解蛋白50 μg，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳后，电转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，分别加入caspase-3、cleaved caspase-3、p38 MAPK、p-p38 MAPK、Bax、Bcl-2、p53、acetylated p53以及细胞色素C抗体，4℃过夜，洗膜后，加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1 ∶5 000稀释)，37 ℃孵育1.5 h；洗膜后加ECL试剂。采用ODYSSEY双色红外激光成像系统(美国LICOR公司)扫描。用美国UVP公司LabWorks 4.5分析系统软件对Western blot条带进行定量分析。

1.2.5 实时定量PCR(real-time PCR)检测 TRIzol法提取系膜细胞总RNA，采用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA。所用引物均由上海生工生物技术公司合成。Bcl-2引物序列，正义5′-GGCGGAGAACAGGGTACGATAAC-3′, 反义5′-CGGGATGCGGCTGGATGGGG-3′；Bax引物序列，正义5′-GCTTGCTTCAGGGTTTCATCCA-3，反义5′-TGTCCACGGCGGCAATCATC-3′；18S rRNA引物序列，正义5′-ACACGGACAGGATTGACAGA-3′，反义5′-GGACATCTAAGGGCATCACAG-3′。扩增条件为：预变性 95°C 30 s，进入循环，95 ℃ 5 s，57～59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s扩增40个循环。以18S rRNA作为内参照校正，用2-△△Ct法分析基因的相对表达。

1.2.6 FCM检测细胞内ROS 使用荧光探针5-(6)-羧基-2 ,7 -二氯荧光素(CM-DCHF-DA, Invitrogen) 检测细胞内ROS含量。MMCs接种于6孔板内，分组刺激48 h，洗涤细胞，胰酶消化，悬浮于PBS，最后加入含 10 μmol·L-1DCHF-DA的染液，37 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 SRT1720对高糖诱导的系膜细胞凋亡的影响 TUNEL和流式细胞术检测结果表明，与NG组相比，在高糖刺激48 h，小鼠系膜细胞凋亡细胞数明显增加(P<0.01)；与HG组相比，SRT1720干预能够明显减少高糖诱导的细胞凋亡数(P<0.05，Fig 1)。此外，与正常对照组相比，渗透压(甘露醇)对细胞凋亡无明显影响。

2.2 SRT1720对高糖诱导的系膜细胞凋亡相关分子表达的影响 与NG组相比，HG糖组cleaved caspase-3表达和Bax/Bcl-2蛋白和mRNA比率明显增加(P<0.01)；SRT1720干预能够明显抑制HG诱导的 cleaved caspase-3表达和Bax/Bcl-2蛋白和mRNA比率(P<0.05，Fig 2)。此外，甘露醇对系膜细胞cleaved caspase-3表达和Bax/Bcl-2蛋白和mRNA比率无明显影响。

2.3 SRT1720对HG诱导的系膜细胞线粒体细胞色素C释放的影响 亚细胞提取物的Western blot结果显示，HG刺激系膜细胞48 h，与正常糖对照组相比，高糖组胞质中的细胞色素C水平明显增加(P<0.01)；与高糖组相比，SRT1720干预组细胞胞质中细胞色素C水平明显降低(P<0.05，Fig 3)。甘露醇组与正常对照组相比，胞质中细胞色素C水平无明显差异。

2.4 SRT1720对HG诱导系膜细胞p53乙酰化的影响 在高糖刺激的48 h，与NG组相比，HG组乙酰化p53水平明显升高(P<0.01)；与高糖组相比，SRT1720干预组乙酰化p53水平明显降低(P<0.05，Fig 4)。甘露醇组与正常对照组相比，乙酰化p53水平无明显差异。

Fig 1 Effect of SRT1720 on HG-induced apoptosis in MMCs(n=6)

Apoptosis was detected by TUNEL(A) and flow cytometry(B). NG: 5.6 mmol·L-1glucose; M: 5.6 mmol·L-1glucose+24.4 mmol·L-1mannitol; HG: 30 mmol·L-1glucose; HG+SRT: 30 mmol·L-1glucose+10 μmol·L-1SRT1720.**P<0.01vsNG;#P<0.05vsHG

2.5 SRT1720对HG诱导的系膜细胞Sirt1表达以及ROS产生的影响 与NG组相比，HG组Sirt1蛋白水平表达明显降低(P<0.01)；SRT1720干预能够增加高糖诱导的系膜细胞Sirt1蛋白的表达(P<0.05，Fig 5A)。与NG组相比，高糖组系膜细胞ROS产生明显升高(P<0.01)；SRT1720干预能够明显减少高糖诱导的ROS产生(P<0.05，Fig 5B)。与正常对照组相比，甘露醇对系膜细胞Sirt1表达和ROS产生无明显影响。

Fig 2 Effect of SRT1720 on HG-induced activation of caspase-3 and expression of Bax and Bcl-2 in MMCs(n=6)

A:The protein expression of cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 was detected by Western blot; B: The mRNA expression of Bax and Bcl-2 was detected by real-time PCR. NG: 5.6 mmol·L-1glucose; M: 5.6 mmol·L-1glucose+24.4 mmol·L-1mannitol; HG: 30 mmol·L-1glucose; HG+SRT: 30 mmol·L-1glucose+10 μmol·L-1SRT1720.**P<0.01vsNG;#P<0.05vsHG

Fig 3 Effect of SRT1720 on HG-induced release of cytochrome C from mitochondria to cytoplasm in MMCs(n=6)

NG:5.6 mmol·L-1glucose; M:5.6 mmol·L-1glucose+24.4 mmol·L-1mannitol; HG: 30 mmol·L-1glucose; HG+SRT: 30 mmol·L-1glucose+10 μmol·L-1SRT1720.**P<0.01vsNG;#P<0.05vsHG

Fig 4 Effect of SRT1720 on HG-induced acetylated p53(Ac-p53) in MMCs(n=6)

NG: 5.6 mmol·L-1glucose; M: 5.6 mmol·L-1glucose+24.4 mmol·L-1mannitol; HG: 30 mmol·L-1glucose; HG+SRT: 30 mmol·L-1glucose+10 μmol·L-1SRT1720.**P<0.01vsNG;#P<0.05vsHG

Fig 5 Effect of SRT1720 on HG-induced Sirt1 expression and ROS production in MMCs(n=6)

A: The protein expression of Sirt1 was detected by Western blot; B: Intracellular ROS was detected by flow cytometry. NG: 5.6 mmol·L-1glucose; M: 5.6 mmol·L-1glucose+24.4 mmol·L-1mannitol; HG: 30 mmol·L-1glucose; HG+SRT: 30 mmol·L-1glucose+10 μmol·L-1SRT1720.**P<0.01vsNG;#P<0.05vsHG

2.6 SRT1720对HG诱导系膜细胞p38 MAPK激活的影响 在高糖刺激的48 h，与NG组相比，HG组p38 MAPK的磷酸化水平明显升高(P<0.01)；与高糖组相比，SRT1720干预组p38 MAPK磷酸化水平明显降低(P<0.05，Fig 6)。甘露醇组与正常对照组相比，p38 MAPK磷酸化水平无明显差异。

3 讨论

研究表明[8]，在糖尿病时，肾脏蓄积的大量ROS参与了糖尿病肾病的发病过程。系膜细胞是肾小球中的固有细胞之一，系膜细胞的凋亡在糖尿病肾病的发生、发展中发挥着重要作用。研究表明，实验性糖尿病肾病肾小球固有细胞数量可通过细胞凋亡而减少，并且肾小球系膜细胞凋亡数与蛋白尿的程度密切相关[9]。高糖能够明显诱导体外培养系膜细胞的凋亡，而抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸、二亚苯基碘及维生素C能够明显抑制高糖诱导的小鼠系膜细胞的凋亡[1]。我们的研究也证实，抗氧化肽SS-31以及抗氧化剂tempol均能够抑制高糖诱导的系膜细胞凋亡[3,10]。以上提示，氧化应激参与了糖尿病状态下肾脏系膜细胞的凋亡。

Fig 6 Effect of SRT1720 on HG-induced activation of p38 MAPK in MMCs(n=6)

NG: 5.6 mmol·L-1glucose; M: 5.6 mmol·L-1glucose+24.4 mmol·L-1mannitol; HG: 30 mmol·L-1glucose; HG+SRT: 30 mmol·L-1glucose+10 μmol·L-1SRT1720.**P<0.01vsNG;#P<0.05vsHG

Sirt1为哺乳动物Sirtuins家族成员之一，是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙酰化酶，在人组织中广泛表达, 参与了细胞的生存、衰老、凋亡和代谢等生物学过程。研究表明，Sirt1的激活剂白藜芦醇具有明显的抗氧化功能[11]。以往的研究已证实，Sirt1与糖尿病肾病密切相关。肾小管细胞过表达Sirt1能够改善糖尿病动物的蛋白尿[12]。白藜芦醇通过激活Sirt1对2型糖尿病小鼠肾脏具有明显保护作用[5]。本研究结果显示， Sirt1的激活剂SRT1720能够明显提高HG诱导的系膜细胞Sirt1表达，抑制HG诱导的MMCs内 ROS产生、细胞凋亡、cleaved caspase-3表达、Bax/Bcl-2比率和细胞色素C的易位。这些结果表明，SRT1720抑制HG诱导的系膜细胞凋亡可能是通过增加Sirt1表达、减少ROS和保护线粒体功能实现的。

p53是一个重要的抑癌基因，它可以通过乙酰化而激活，激活的p53能够诱导多种基因表达，导致细胞周期阻滞或凋亡。Sirt1过表达能够通过抑制p53的乙酰化，减少过氧化氢诱导的小鼠系膜细胞的凋亡[13]。体内外实验证实，Sirt1能够直接和p53蛋白结合，从而抑制p53的乙酰化以及细胞凋亡[14]。本研究结果显示，高糖刺激系膜细胞48 h，细胞内p53乙酰化水平明显升高，而SRT1720干预能够抑制高糖诱导的p53的乙酰化。以上结果提示，SRT1720抑制高糖诱导的细胞凋亡可能部分是通过调控p53的乙酰化实现的。

p38蛋白激酶(p38 MAPK)为丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，是一个重要的信号分子，参与调控包括细胞凋亡在内的许多细胞功能。Jung等[15]的研究显示，给予FR 167653(一种p38 MAPK抑制剂)，能够改善糖尿病肾小球和HG诱导的系膜细胞凋亡。阻断p38 MAPK通路能够减少HG诱导的系膜细胞凋亡、cleaved、caspase-3表达、Bax/Bcl-2比率[10]。以上说明，p38 MAPK信号通路与系膜细胞凋亡密切相关。本研究显示，SRT1720能够明显抑制HG诱导的p38 MAPK的活化，提示SRT1720抑制HG诱导的MMCs凋亡可能部分是通过调节p38 MAPK通路活化实现的。

综上所述，SRT1720能够抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡，这种作用可能是通过激活Sirt1,减少ROS产生，保护线粒体功能，抑制p53乙酰化以及p38 MAPK信号通路激活而实现的。

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Influence of SRT1720 on apoptosis of high glucose-induced mouse mesangial cells

LIU Jing1,2, ZHANG Rui1, LI Guan-qing1, SHI Yong-hong1,3
(1.DeptofPathology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China; 2.DeptofNephrology,KailuanGeneralHospital,TangshanHebei063000,China;3.HebeiKeyLabofKidneyDiseases,Shijiazhuang050017,China)

Aim To investigate the effect of Sirt1 activator SRT1720 on high glucose(HG)-induced apoptosis in mouse mesangial cells(MMCs).Methods Cultured mouse MMCs were divided into normal glucose group(NG), NG plus mannitol group(M), high glucose group(HG), HG plus SRT1720 group(HG+SRT). Apoptosis of MMCs was analyzed by DeadEndTMFluorometric TUNEL System and flow cytometry. Reactive oxygen species(ROS) production was observed by flow cytometry. The expression levels of caspase-3, cleaved caspase-3, Bax, Bcl-2, p38 MAPK, p-p38 MAPK, p53, acetylated p53 and cytochrome C protein were observed by Western blot. The mRNA levels of Bax and Bcl-2 were detected by real-time PCR. Results Compared with normal glucose group, the production of ROS, the number of cell apoptosis, the expression of cleaved caspase-3, p-p38 MAPK and acetylated p53 and ratio of Bax/Bcl-2 were significantly increased, the expression of Sirt1 was decreased, meanwhile, the release of cytochrome C from mitochondria to cytoplasm was significantly increased in MMCs in high glucose group. Treatment with SRT1720 inhibited HG-induced increase of ROS production, cell apoptosis, expression of cleaved caspase-3, acetylated p53 and p-p38 MAPK, ratio of Bax/Bcl-2 and release of cytochrome C, and reversed HG-induced Sirt1 expression.Conclusion SRT1720 could prevent HG-induced apoptosis maybe by decreasing ROS production, preserving mitochondrial function and inhibiting p53 acetylation and activation of p38 MAPK in MMCs.

SRT1720; mouse mesangial cells; apoptosis; oxidative stress; Sirt1; p53

2017-05-10,

2017-06-12

国家自然科学基金资助项目(No 81370825，81470966)

刘 静(1977-)，女，硕士，副主任医师，研究方向：肾脏病学，E-mail: lj_ts@sohu.com； 史永红(1970-)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：肾脏病理学，通讯作者，E-mail: yonghongshi@163.com

时间：2017-7-7 11:05 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.048.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.024

A

1001-1978(2017)08-1164-06

R-332；R322.61；R329.25；R587.2；R977.3