卵白蛋白肽的磷酸化改性工艺优化

刘丽莉，李 玉，梁严予，李 丹，杨陈柳

(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023)



卵白蛋白肽的磷酸化改性工艺优化

刘丽莉，李 玉，梁严予，李 丹，杨陈柳

(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023)

在试验确定酶解制备卵白蛋白肽的最优工艺条件基础上，对酶解后鸡蛋清卵白蛋白肽磷酸化改性工艺进行了研究。以磷酸化程度为指标，确定最佳磷酸盐为三聚磷酸钠。通过单因素和四元二次正交旋转组合试验，研究了磷酸化工艺，确定最优工艺条件组合为：反应温度30 ℃、pH值8.0、反应时间4 h、三聚磷酸钠添加量(质量分数)9%，在此条件下磷酸化程度可达到(57.27±1.68) mg/g。通过紫外光谱扫描，对磷酸化改性的卵白蛋白肽进行结构变化分析。研究结果表明：磷酸化改性的卵白蛋白肽的紫外吸收峰发生了红移，卵白蛋白分子的有序二级结构减少。由于磷酸基团的嵌入，卵白蛋白肽的结构发生了变化，使得磷酸化改性后的卵白蛋白肽的紫外最大吸收峰增强。

卵白蛋白肽；磷酸化；工艺优化

0 引言

中国禽蛋深加工产品的品种单一，仅为鲜蛋总量的0.3%，而发达国家深加工蛋品为鲜蛋总量的20%，且蛋制品加工率很高[1]。由于鲜鸡蛋在运输过程中易破碎、变质，所以需要将新鲜的蛋清制备成蛋清粉[2]。随着市场对蛋清粉需求量的增大，对蛋清粉功能和性质的要求也越来越严格。目前，中国在专用蛋清粉的开发方面一直未得到有效解决。因此，应用适当的方法对蛋清粉的特性进行改造并开发出功能性的蛋清粉，对于拓展其在食品及其他领域的应用将具有非常重要的意义。

目前，用于蛋白质改性的方法很多。文献[3]利用三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphate，STP)对花生蛋白进行磷酸化化学改性试验，当STP添加量(质量分数)为7.77%时，花生分离蛋白的持水性、乳化特性、吸油(水)性和泡沫稳定性，比未改性的蛋白都有明显地改善。文献[4]在pH值为4.0、85 ℃的条件下，干燥加热卵转铁蛋白1 d，卵转铁蛋白中磷的质量分数提高了0.91%，电泳迁移率也增加了，但溶解度略有下降；而改性后的卵转铁蛋白在pH值为7.0、70 ℃加热10 min，磷酸化卵转铁蛋白70%以上被溶解，磷酸钙溶解能力增强，乳化性也有所改善。文献[5]以鸡蛋中卵白蛋白(ovalbumin，OVA)为对象，利用离子色谱法，简便、快捷地得到了鸡蛋OVA的提取工艺路线，采用多种抗氧化活性试验，研究了鸡蛋OVA酶解物的抗氧化活性，为全面开发鸡蛋的新型抗氧化肽产品奠定了基础。文献[6]研究了壳寡糖的糖基化和交联对大豆蛋白性质和结构的影响，证明了转谷氨酰胺酶诱导的壳寡糖的糖基化和交联能够对大豆蛋白进行改性。

综上所述，目前，对蛋白质进行磷酸化的研究报道相对较多，但是针对卵白蛋白肽的磷酸化研究未见报道。磷酸化改性蛋白质是为机体提供磷元素的一种有效、实用的方法，其作用主要是提高蛋白质的溶解度和降低其等电点，从而达到改变其功能特性的目的。因此，本文以酶解后的卵白蛋白肽为反应物，研究其磷酸化改性的最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售鲜鸡蛋，购于洛阳市丹尼斯超市；STP、焦磷酸锌、铬黑T、三氯乙酸均为分析纯，购于上海瀚思化工有限公司；氢氧化钾(分析纯)，购于济宁泰诺化工有限公司；磷酸氢二钠(分析纯)、磷酸二氢钾(分析纯)，购于天津市鲁鑫化工科技有限公司；乙二胺四乙酸二钠(分析纯)，购于郑州新天和化工产品有限公司。

1.2 仪器与设备

Labconco型真空冷冻干燥机，无锡凯派克斯科技有限公司；GL-36KT-A型超速冷冻离心机，深圳市三利化学品有限公司；UV-7500型紫外分光光度计，美国Beckman公司。

1.3 方法

OVA肽的制备：配制质量分数为5%的OVA溶液，调节pH值至8.2，在52.5 ℃的水浴锅中预热10 min 后，加入5 500 U/g的碱性蛋白酶，酶解5 h。酶解反应结束后，将反应物置于90 ℃的水浴锅中5 min，使酶钝化，冷却至室温，4 500 r/min离心，取上清液冷冻干燥，得到酶解后的OVA肽[7]。

磷酸化OVA肽的制备：取一定量的OVA肽溶于0.02 mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，配制成0.01 g/mL的蛋白质溶液。调节pH值至7.0～8.5，磷酸盐添加量为3%～9%，磁力搅拌2.5～3.5 h，4 ℃蒸馏水透析48 h，检测磷酸化程度，冷冻干燥备用。

针对STP、焦磷酸钠、磷酸氢二钠进行初步筛选，通过单个磷酸化OVA肽试验，分析比较各磷酸盐的磷酸化程度，筛选出最佳磷酸化的磷酸盐。

分别考察反应温度(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)、反应pH值(7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)、反应时间(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h)和磷酸盐添加量(质量分数：6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%)对磷酸化程度的影响。

在单因素试验的基础上，利用数据处理系统(data processing system,DSP)软件进行四元二次正交旋转组合设计。以反应温度、反应pH值、反应时间和磷酸盐添加量4个因素为自变量，磷酸化程度为指标，设立了23个处理组，因素水平处理编码见表1。

表1 因素水平处理编码表

取一定量透析处理过的磷酸化改性后的OVA肽溶液，加入三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)溶液使蛋白质沉淀，5 000 r/min离心后，向上清液中加入1 mol/L的乙酸锌2 mL，使其中的焦磷酸在pH值3.8～3.9条件下以Zn2P2O7形式沉淀。然后，将焦磷酸锌溶于pH值为10的氨缓冲液，用铬黑T作指示剂，用0.01 mol/L的乙二胺四乙酸二钠标准溶液滴定，当溶液的颜色由紫红色变为蓝色时，即到达了滴定终点[8]。计算公式[9]为：

其中：C为乙二胺四乙酸二钠标准溶液的浓度，mol/L；V1为滴定空白所需乙二胺四乙酸二钠标准溶液的体积，mL；V2为滴定样品所需乙二胺四乙酸二钠标准溶液的体积，mL；MP为磷的相对原子质量，MP=30.97；m为样品的质量，g。

1.4 紫外光谱测定

分别将OVA肽和磷酸化改性的OVA肽溶于50 mmol/L、pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液中，配制成0.01 mg/mL蛋白溶液，用紫外分光光度计在200～400 nm波长处对样品进行扫描[10]。

1.5 数据分析

采用DPS V7.0专业版软件和Design Expert 8.0软件对正交旋转试验进行分析，并作响应曲面图和等高线图，其他结果通过Origin Pro 8.5软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 磷酸盐的确定

按照以上试验方法针对3种磷酸盐进行筛选，筛选结果表明：STP的磷酸化程度显著优于焦磷酸钠和磷酸氢二钠(P<0.05)。STP分子式为Na5P3O10，比焦磷酸钠和磷酸氢二钠多1～2个磷酸基团，因此与蛋白质分子的结合概率较大，磷酸化程度也随之变大。利用STP对蛋白质进行磷酸化改性，不仅可以改善蛋白质的功能特性，而且还可以在不影响蛋白吸收的情况下，提高其营养价值。相关研究表明：STP改性蛋白质是符合食品安全标准的，美国食品药品管理局允许使用STP作为食品添加剂[11]。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 反应温度和反应pH值的确定

通过对反应温度进行单因素试验，试验结果表明：开始时OVA肽的磷酸化程度随反应温度升高而增大；在反应温度35 ℃左右，OVA肽的磷酸化程度达到最大值；随后磷酸化程度开始下降。因此，最佳磷酸化反应温度为35 ℃。

在其他反应条件确定后，改变反应pH值，开始时OVA肽的磷酸化程度随反应pH值的升高而增大；在pH值达到9.0左右，OVA肽的磷酸化程度达到最高值；随后磷酸化程度开始下降。因此，最佳磷酸化反应pH值为9.0。

2.2.2 反应时间和STP添加量的确定

单因素试验结果表明：随着反应时间的增加，OVA肽的磷酸化程度也随之增大；在反应3 h左右，OVA肽的磷酸化程度达到最大值；随后磷酸化程度基本保持不变。因此，最佳磷酸化反应时间为3 h。

在其他反应条件确定后，改变STP添加量，随着STP添加量的增加，OVA肽的磷酸化程度也随之增大；当STP添加量达到9%时，继续增加STP添加量，OVA肽的磷酸化程度基本保持不变。因此，选择最佳STP添加量为9%。

2.3 正交试验结果

在单因素试验的基础上，对四元二次正交旋转组合试验进行二次响应面回归模型方差分析，结果见表2。

表2 二次响应面回归模型方差分析结果

根据回归模型方差分析可知：回归方程的失拟性检验F1=61.576 20(F0.05(6,5)=6.98)不显著，所以认为本次选用的二次回归模型是合适的。此模型的决定系数R2=0.92，说明响应面回归模型达到高显著水平(P<0.000 1)，表明该模型拟合结果好，能够正确反映各因素与磷酸化程度的数量关系。经方差分析(见表2)，采用DPS软件对回归试验得到的数据进行拟合，剔除不显著项，得到的回归方程如下：

Y= 58.286 74+9.535 95X2+5.017 44X3-7.050 00X1X3+

2.4 响应面和等高线分析

为了使各因素对OVA肽磷酸化程度的影响能够更加直观地显现出来，利用DPS软件在P<0.01水平上，作出显著项的两因素交互影响OVA肽磷酸化程度的响应面等高线图，如图1所示。根据图1可对两因素交互影响磷酸化程度进行分析评价，从中得出最佳因素水平。

图1 两因素交互影响OVA肽磷酸化程度的响应面等高线

从图1a中可以看出：反应温度和反应时间两因素对磷酸化程度的影响呈抛物曲线形。随着反应温度的上升，磷酸化程度呈先增长后下降的趋势；随着反应时间的增加，磷酸化程度也呈增加趋势。等高线的密度大小可以反映出磷酸化程度变化的快慢，在温度20 ℃，时间低于4 h，该区域内两因素稍微变化就会引起磷酸化程度的变化，等高线呈椭圆形[12]，表明反应温度和反应时间对OVA肽磷酸化程度的交互作用显著。

从图1b中可以看出：反应温度和STP添加量对磷酸化程度的影响不同。等高线的密度大小可以反映出磷酸化程度变化的快慢，在反应温度低于30 ℃，STP添加量低于9%时，该区域内两因素稍微变化就会引起磷酸化程度的变化，等高线呈椭圆形，表明反应温度和STP添加量对OVA肽磷酸化程度的交互作用显著。

2.5 确定最佳作用参数和模型验证试验

图2 改性前后OVA肽的紫外光谱分析图

采用DPS V7.5专业版软件和Design Expert 8.0软件进行分析，得到OVA肽的最佳磷酸化条件组合为：反应温度30 ℃、pH值为8.0、反应时间4 h、STP添加量9%，可得到最高预测磷酸化程度为58.96 mg/g。通过验证试验所得的磷酸化程度平均为(57.27±1.68) mg/g，偏差绝对值小于3%，表明通过优化的磷酸化条件可行。

2.6 磷酸化改性OVA肽的紫外光谱分析

紫外光谱是利用样品分子对紫外光和可见光的吸收程度，判定样品的组成成分、结构及含量。对改性前后的OVA肽进行紫外光谱分析，结果见图2。

由图2可看出：改性前后的OVA肽在280 nm附近都有强烈的吸收峰，这是由于OVA肽所特有的吸收峰一般在280 nm左右。由于色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)残基的侧链基团对光的优先吸收，以及苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)、半胱氨酸(Cys)残基的侧链基团和肽键对光的吸收，并且Trp和Tyr在波长280 nm周围有一个吸收峰，因此，蛋白质能够吸收一定波长范围的紫外光[13]。由于磷酸基团的嵌入，OVA肽的结构又发生了变化，使得磷酸化改性后的OVA肽的紫外最大吸收峰增强[14]。

3 结论

(1)单因素试验确定磷酸化改性条件：最佳磷酸盐为STP。选择反应温度、反应pH值、反应时间和STP添加量为4个因素，以磷酸化程度为指标，确定各因素最佳值为：反应温度35 ℃，pH值9.0，反应时间 3 h，STP添加量(质量分数)9%。

(2)正交旋转组合试验设计优化磷酸化工艺。在单因素试验的基础上，采用四元二次正交旋转组合设计，以磷酸化程度为指标，通过响应面和回归方程得到最佳工艺条件组合为：反应温度30 ℃、pH值8.0、反应时间4 h、STP添加量(质量分数)9%，在此条件下预测磷酸化程度可达到58.96 mg/g。经验证试验得到指标值为(57.27±1.68) mg/g，表明通过优化的磷酸化条件可行。

(3)通过紫外光谱对OVA肽和磷酸化改性的OVA肽进行结构分析。磷酸化改性的OVA肽的紫外吸收峰发生了红移，OVA分子的有序二级结构减少。由于磷酸基团的嵌入，OVA肽的结构也发生了变化，使得磷酸化改性后的OVA肽的紫外最大吸收峰增强。

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国家自然科学基金项目(31401622);河南省重点科技攻关基金项目(152102110080);河南省教育厅自然科学研究基金项目(13A550255);河南科技大学高级别项目培育基金项目(2013ZCX012)

刘丽莉(1974-),女,河南商丘人,副教授,博士,主要研究方向为畜产品加工技术.

2016-09-29

1672-6871(2017)03-0069-05

10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2017.03.015

TS253.1

A