不同寄主来源的葡萄霜霉病菌的孢子囊大小和致病力分化的测定

刘志君，莫光珍，张书溢，易图永,3,4

（1湖南农业大学植物保护学院，长沙410128；2湖南省靖州县农业局，湖南靖州418400；3植物疾病控制与利用湖南省高校重点实验室，长沙410128；4植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，长沙410128）

不同寄主来源的葡萄霜霉病菌的孢子囊大小和致病力分化的测定

刘志君1，莫光珍2，张书溢2，易图永1,3,4

（1湖南农业大学植物保护学院，长沙410128；2湖南省靖州县农业局，湖南靖州418400；3植物疾病控制与利用湖南省高校重点实验室，长沙410128；4植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，长沙410128）

为了减少葡萄霜霉病在经济上造成的损失，采集湖南、福建、江西三省的不同地区、不同葡萄品种的19份葡萄霜霉病菌，检测了它们的孢子囊大小和在‘户太八号’、‘夏黑’、‘醉金香’、‘紫秋葡萄’、‘维多利亚’5个不同葡萄品种的致病力差异。通过保湿培养病原菌，再接至健康叶片上，根据孢子萌发法测长度和叶盘法测其致病力。结果表明，采自不同葡萄品种的霜霉病菌孢子囊大小存在一定的差异，来源于‘刺葡萄’的病原菌孢子囊明显大于来源于‘巨峰’、‘红地球’上的霜霉病菌孢子囊；来源于江西的菌株致病性普遍较强，而来源于湖南的菌株致病性普遍较弱。欧美杂交种葡萄，如‘户太8号’、‘夏黑’、‘醉金香’，其病情指数相对较低；欧亚杂交种和东亚种葡萄，如‘维多利亚’，‘紫秋葡萄’，其病情指数相对偏高。上述结果表明，采集自不同寄主的葡萄霜霉病菌的致病力和孢子囊大小均存在一定程度的分化。

葡萄霜霉病菌；分化；致病力；病情指数；孢子囊大小

0 引言

葡萄霜霉病(Grape downy mildew)是葡萄生产中的主要病害[1-3]，由葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)引起的，可造成大面积减产，进而造成巨大经济损失，是制约葡萄产业发展的一大瓶颈。葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)是一种古老的世界性病害，在雨热同季地区发生尤其严重，是葡萄稳产、高产的主要限制因素之一[4]。葡萄霜霉病属多循环气传病害，一旦环境条件适宜，易于迅速发生和流行，极具毁灭性[5-6]。同时，葡萄霜霉病潜育期短、再侵染频繁、病菌繁殖率高的特点[7]，葡萄霜霉病害在我国各地的葡萄产区普遍发生，该病原菌致病力分化明显。目前，国外方面，有研究表明来自各地的葡萄霜霉病菌呈现出鲜明的寄主专化性。在孢子囊形态方面，不同来源的霜霉病菌差异明显[8]。国内，目前对葡萄霜霉病的研究大致是对发病情况、田间消长规律、防治药剂筛选以及抗性鉴定的研究，在致病力方面，刘旭等[9]和黄晓庆等[10]研究了新疆、重庆、河北、陕西、辽宁地区来源不同的葡萄霜霉病病株的致病力和孢子囊形态。为了研究湖南、江西、福建3个省份葡萄霜霉病菌致病性的分化情况，本研究针对不同地区葡萄霜霉病菌，研究其在致病力上的分化，采集湖南、江西、福建3个省份19株典型葡萄霜霉病菌开始致病性研究，统计19株菌株的致病性数据，在病害的综合防治方面，提供了重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 分别采自湖南、福建、江西省地的‘巨峰’、‘红宝石’、‘红瑞宝’、‘金手指’、‘刺葡萄’、‘红地球’6个品种，详细信息见表1。

表1 菌株收集信息详情

1.1.2 接种材料 在一周无施药的情况下，从湖南农业大学耘园葡萄种植基地采集‘户太八号’、‘夏黑’、‘醉金香’、‘刺葡萄’和‘维多利亚’葡萄叶片。再用直径10 mm的打孔器取分别在其5个不同品种的叶片上取下20个叶盘进行实验[11]。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的采集与培养 把釆回的新鲜葡萄霜霉病感病叶片进行蒸馏水洗涤[12]，置于垫有湿滤纸的托盘中进行时长24 h的保湿培养，待新生孢子囊长出后马上将其刮下，再用无菌水配制成孢子囊悬浮液，同时统计其浓度，1.6×105个/mL为宜。在配成的孢子囊悬浮液后，于室温下培养1～2 h，再取一滴孢子囊悬浮液置于显微镜下观察，当有游动孢子出现时，则可以进行接种|13]。

1.2.2 不同来源寄主葡萄霜霉病菌孢子囊大小的测量从收集的病样上挑取少许孢子囊，配制成孢子囊悬浮液，做成玻片放于10×40倍显微镜下统计其数据，再任意每个样品里挑50个孢子囊记录其长宽数据，最后对其统计其方差。1.2.3致病力测定 在托盘中放置1张裁剪好并且使用蒸馏水将滤纸沾湿，用横五竖四排列方式将同一品种的20个叶盘排列在一个角落。将20 μL孢子囊悬浮液先滴在前3列的15个叶盘上，然后再用20 μL蒸馏水滴在最后1列的5个叶盘作为对照。用保鲜膜封住托盘进行保湿，置于温度为22℃，相对湿度95%的人工气候箱中培养中，再进行12 h光照[14]。通常在接菌后3～4天，白色菌丝会出现在叶片上，5～10天后，侵染达到顶峰。此时记录其发病情况，根据葡萄霜霉病在离体接种上的分级标准（表2）和葡萄霜霉病在抗感级上的级别分化标准（表3）计算出病情指数，反复3次，再取其平均值[15]。

表2 葡萄霜霉病在离体接种上的分级标准

表3 葡萄霜霉病在抗感级上的级别分化

以被接种叶盘的病情指数作为抗性分级的指标和鉴定效果分析。病情指数的计算见公式(1)。

2 结果与分析

2.1 致病力测定结果

从长沙市长沙县、福州永泰、赣州兴国、怀化靖州、怀化麻阳、怀化中方、怀化芷江、衡阳衡山、衡阳市衡阳县、南昌新建、萍乡芦溪、邵阳洞口、新余分宜、宜春万载、永州新田、漳州长泰17个地方收集得到的19株葡萄霜霉病菌，通过致病力试验显示，19株样品都能感染5个葡萄品种的发病。介于葡萄品种在抗病性上的高低和葡萄霜霉病菌在上致病力的分化，其发病程度上有所差异。在发病症状方面，初期时，叶盘发病有半透明的不规则浅褐色油绩状斑点长出，病情加重后，逐渐融合成黄褐色不定形的大病斑[16-18]，最后在病斑部位出现白色霜状霉层[19]（图1）。

在‘户太八号’葡萄上，宜春布塘的菌株的致病性最强，长沙市长沙县2015年的样品致病性最弱；在‘夏黑无核’葡萄上，宜春万载的菌株具有最强的致病性，湖南省衡阳衡山的菌株致病性最弱；在‘醉金香’葡萄上，萍乡芦溪的菌株具有最强的致病性，永州新田的菌株致病性最弱；在‘维多利亚’葡萄上，萍乡芦溪的菌株具有最强的致病性，邵阳洞口的菌株致病性最弱；在‘紫秋葡萄’上，南昌新建的病株引起发病能力最高，衡阳衡山的样品引起发病能力最低。

从整体上看来（表4），来自萍乡芦溪的菌株致病性最强，源于衡阳衡山的菌株致病性最弱。综合所有数据，从江西省采集的样品致病性普遍较强，而从湖南省采集的样品致病性普遍较弱。

2.2 不同地理位置采集霜霉病株在孢子囊大小的测量

测量不同地区病株的孢子囊大小，结果（表5）显示，不同地区病株的孢子囊大小具有明显差异(F=43.34，P＜0.05)。所有样品中，孢子囊最长可达到35.26μm，最短是 11.42 μm。孢子囊最宽可达到 25.37 μm，最窄是8.03 μm。

图1 葡萄叶盘发病图

表4 不同地理位置采集的葡萄类别的样品在致病力上的测定

为了更加透彻孢子囊大小的改变规则，把之前病株按类别进行不同排比，观察其群体内及群体间孢子囊大小。不同地区来源的霜霉病菌类别间的孢子囊长度(F=52.38，P＜0.05)和宽度(F=68.12，P＜0.05)都存在显著差异（图2）。结果显示，来源于‘刺葡萄’菌株的孢子囊在长宽上明显大于其余品种。来自于‘红地球’、‘巨峰’、‘红宝石’的菌株在孢子囊在长宽数据方面上无明显差别；而收集自同一类别无论是同一地理位置采集还是不一样的地理位置采集的葡萄样品在孢子囊大小方面都有明显差别（图3），因而得出病原菌的孢子囊大小和对应收集的地理位置目前无显著相关的结论。然而非同一类别的霜霉病菌在孢子囊大小上的确有特定程度的分化。

续表4

表5 不同地区葡萄霜霉病菌的孢子囊大小

图2 非同一类别来源的葡萄霜霉病群体孢子囊大小

图3 相同寄主来源的葡萄霜霉病群体在孢子囊大小上的比较

3 讨论

孢子囊萌发方面，前有研究报道，霜霉病游动孢子会向气孔游动形成休止孢，长出芽管从气孔侵入。经摸索后发现高浓度在发病上能产生更好效果，最终决定用1.6×105/mL来作为病菌处理的浓度，这也与Polesani等[20]、Díez-navajas等[21]、Liu等[22]在研究中所使用的孢子囊量相近，可以实现较好的发病效果。

相比于之前刘旭等[9]和李荣[12]的研究，研究创新点在于2015年和2016年的同一时间在长沙县和怀化中方处地点进行采样。相对以往地点采集，本研究的反复步骤更加具有意义。

由于致病力测量试验还不具有一套成规及成熟的寄主，所以在不同的试验中采用的致病力测量的寄主也许有一定的差异。因为隶属于活体营养专性寄生菌，葡萄霜霉病菌在活菌的保留和扩繁操作上，具有些许困难。所以对于不同寄主的病原菌的收集十分受限。这在特定程度上不利于本试验对其发病能力的更深入统计和证明。建议以后采集更多省份的病株，以及每年同一时间在同一地点重复采集样品进行比较，这样数据能更据说服力。

为了更加接近田间反应以及节约成本，本试验采取叶盘法对霜霉病菌的发病能力实行检测，数据表示不同病株对相同处理叶片的发病表现不同，而且来自非同一类别的病菌群体之间的发病能力差别明显。根据研究结果可以看出，在19个葡萄霜霉病菌株中具有显著的致病性分化现象，在5个不同葡萄品种上都能表现出不同程度的致病性并且菌株发病能力的强弱和葡萄品种有特定程度的联系。在5个供试葡萄品种中，‘户太八号’、‘夏黑无核’、‘醉金香’隶属对葡萄霜霉病抗病性较高的欧美杂交种葡萄，因此其病情指数相对较低；而‘维多利亚’和‘紫秋葡萄’分别隶属感病的欧亚杂交种和东亚种葡萄，故其病情指数相对偏高。

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致谢：感谢易图永老师对本试验的指导和对该文章的修改，感谢实验室的马琳和谭玉娴给予的多方面的帮助和支持。

Sporangia Size of Plasmopara viticola from Different Hosts and Determination of Pathogenicity Differentiation

Liu Zhijun1,Mo Guangzhen2,Zhang Shuyi2,Yi Tuyong1,3,4
(1Institute of Plant Protection,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,Hunan,China;2Jingzhou County Agricultural Bureau of Hunan Province,Jingzhou 418400,Hunan,China;3Hunan Provincial Key Laboratory of Plant Disease Control and Use,Changsha 410128,Hunan,China;4Plant Diseases and Insect Pests in Hunan Province Key Laboratory of Biological Prevention and Control,Changsha 410128,Hunan,China)

The aim is to reduce the economic loss of Plasmopara viticola.19 accessions of Plasmopara viticola from different grapes were collected from different areas in Hunan,Fujian and Jiangxi.The sporangia size was determined,and the differences of pathogenicity in‘Hutai No.8’,‘Summer Black’,‘Zuijinxiang’,‘Ziqiu Grape’and‘Victoria’were detected.The pathogenic bacteria were cultivated by moisture culture,and then were inoculated to the healthy leaves.The length was detected by sporangium germination method and the pathogenicity was determined by leaf-disc method.The results showed that the size of downy mildew bacterium sporangium from different grape varieties was different.The pathogenic bacteria sporangium from‘Spine grape’was obviously greater than that of‘Kyoho Grape’and‘Red Earth’.The bacterial strain fromJiangxi had generally stronger pathogenicity,but the bacterial strain from Hunan had generally weaker pathogenicity.European-American cross species grape,such as‘Hutai No.8’,‘Summer Black’and‘Zuijinxiang’had relatively low pathogenicity.European-Asian cross species and East Asian species,such as‘Victoria’and‘Ziqiu Grape’had relative high pathogenicity.The above result indicates that there is a certain differentiation in the pathogenicity and sporangium size of downy mildew collected from different hosts.

Plasmopara viticola;Differentiation;Pathogenicity;Disease Index;Sporangia Size

S436.631.1

A论文编号：cjas16110025

农业部公益行业计划“果树霜霉病综合防控技术研究与示范”(201203035)。

刘志君，男，1992年出生，湖南衡阳人，在读硕士，研究方向：植物病理学。通信地址：410128湖南农业大学植物保护学院，E-mail：349323806@qq.com。

易图永，男，1971年出生，湖南怀化人，教授，研究方向：植物病理学。通信地址：410128湖南农业大学植物保护学院，Tel：0731-84617025，E-mail：yituyong@hotmail.com。

2016-11-17，

2016-12-28。