潮汕地区食管癌血清标本中HPV的抗体检测

叶思 李劲涛 蔡振海 汪杨俊琦 SaraKhodahemmati 赵维坚 李红霞 曾毅

100124 北京工业大学生命科学与生物工程学院病毒与药理室(叶思、李劲涛、汪杨俊琦、Sara Khodahemmati、赵维坚、曾毅)；522000 揭阳市人民医院(蔡振海)；100052 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室(李红霞、曾毅)

·技术方法·

潮汕地区食管癌血清标本中HPV的抗体检测

叶思 李劲涛 蔡振海 汪杨俊琦 SaraKhodahemmati 赵维坚 李红霞 曾毅

100124 北京工业大学生命科学与生物工程学院病毒与药理室(叶思、李劲涛、汪杨俊琦、Sara Khodahemmati、赵维坚、曾毅)；522000 揭阳市人民医院(蔡振海)；100052 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室(李红霞、曾毅)

目的 检测潮汕地区食管癌患者血清中人乳头瘤病毒(HPV)相关抗体的存在情况，为我国食管癌患者的监测提供参考数据。方法 分别构建包含HPV16型E6/E7和HPV18型E6/E7基因的pSecTag重组载体，转染293细胞后分别表达HPV16型E6/E7和HPV18型E6/E7的融合蛋白，以融合蛋白为抗原，用免疫酶法检测76份食管癌患者血清及149份正常体检人群血清中HPV的IgG抗体；用L1做抗原的ELISA法检测相同样本的血清。结果 使用免疫酶法，E6/E7融合蛋白做抗原在所有血清标本中只有一份食管癌患者血清显示免疫阳性；使用ELISA法，L1做抗原，76例食管癌患者中有37例检测到抗体IgG阳性反应，阳性率为48.7%，149例体检人群中，79例有抗体IgG阳性反应，阳性率为53.0%。经统计分析二者无显著性差异。结论 HPV相关抗体检测方法尚不能作为食管癌的筛查工具，HPV感染的血清学检测用于食管癌的诊断有待于进一步的研究。

Fund programs: Beijing University of Technology School Fund (015000514314004)； State key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control of Autonomous Research Project (2012AA02A404); Beijing Natural Science Fund Projects (Z2015001201601)

目前，食管癌是我国高发的一种癌症，多数患者临床发现时已是中晚期，中晚期预后很差。针对食管癌的早期诊断方法进展比较缓慢，血清学诊断预警癌症是目前肿瘤诊断研究的热点，食管癌血清学诊断方法尚无突破。由于我国部分食管癌有HPV的存在，HPV是其重要病因，因此可以探讨HPV相关抗体的检测是否可作为食管癌诊断的指标。相关文献报道中均使用了ELISA法[1,2]，且大多以HPV的病毒样颗粒为抗原来检测HPV相关的IgG抗体。研究结果提示HPV抗体阳性者食管癌发病危险性确实较高，但是HPV相关的血清抗体阳性率较低，约为23%左右[3,4]。为此，本研究借鉴EBV抗体可以预测鼻咽癌的检测思路，将HPVE6/E7癌蛋白做抗原的免疫酶法运用到食管癌血清中HPV相关抗体的检测，同时也采用了病毒样颗粒为抗原目前较为灵敏的酶联免疫吸附法(ELISA)来检测HPV相关抗体做对照，探讨不同方法应用于HPV相关肿瘤血清学检测的可行性。

1 材料与方法

1.1 血清标本来源 样品来自潮汕地区食管癌患者血清76份及体检人群血清149份。抽取食管癌患者以及体检者全血4～5 ml，3 000 g离心3 min，取上清，-20 ℃冰保存备用。登记患者的姓名、年龄等基本信息，电子存档。

1.2 真核表达载体的构建 用内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ将pSecTag2B载体进行双酶切，回收切开的线性质粒。将目的基因片段HPV16型E6/E7基因和HPV18型E6/E7基因与线性pSecTag2B载体连接，形成重组载体。将构建成功的质粒转化到DH5α，氨苄青霉素筛选后扩增培养。用德国Qiagen试剂盒提取无内毒素的质粒DNA，备用。以重组质粒为模板，用合成的引物扩增目的片段，检测载体是否构建成功。

1.3 质粒的转染及表达鉴定 用DMEM高糖培养基(10%FBS，1%PS)培养293细胞，37 ℃，5%CO2培养过夜。待达到60%～70%的细胞融合度后，换无血清DMEM培养基培养。分别将16优化型、18优化型重组质粒及pSecTag2B空质粒导入细胞中。培养4 h后，换含10%FBS的培养基培养细胞。细胞培养48 h后，停止细胞生长。收集细胞，制成细胞涂片。加20 μl 5%BSA到固定的细胞组织上，37 ℃孵育30 min。去掉多余BSA，加20 μl鼠抗myc标签蛋白的一抗到细胞上，37 ℃孵育50 min。去掉多余一抗，PBS洗细胞组织3遍，每遍3 min。加辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37 ℃孵育40 min。弃多余二抗，PBS洗4遍，每遍3 min。配制DAB显色试剂，滴加到细胞组织上，显色2～5 min。终止显色反应，镜下观察。

1.4 免疫酶法(IEMA)检测 在76份食管癌患者血清和149份体检人群血清标本中，使用免疫酶鉴定为阳性表达的细胞为材料，BSA封闭30 min。取食管癌患者血清，稀释5倍，滴30 μl到细胞组织上，37 ℃孵育1 h。加辣根过氧化物酶标记的抗人IgG二抗，37 ℃孵育30 min。加DAB显色液，显色2～5 min。显微镜下观察结果。

1.5 酶联免疫吸附法(ELISA)检测 将所有样品对应微孔按顺序编号，每孔设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照(不加样品及酶标试剂)1孔。在阴性孔中不加样品，加50 μl水或PBS代替，在阳性孔中加50 μl试剂盒提供的阳性对照。在样品孔中加先加40 μl样品稀释液，再加10 μl血清。用封板膜封住后37 ℃孵育30 min，将30倍的浓缩洗液加水稀释至1倍工作液后备用。揭掉封板膜，弃孔中液体，每孔加满洗液，静置30 s后弃液体，重复5次，拍干。每孔加酶标试剂50 μl，空白孔不加，重复上述步骤。每孔加显色剂A 50 μl，再加显色试剂B 50 μl，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μl，终止反应，使用酶标仪检测。

2 结果

2.1 真核表达载体构建结果 由北京天一辉远生物科技有限公司合成引物，HPV16型E6/E7基因的片段大小为771 bp，HPV18型E6/E7基因片段大小为793 bp，两目的片段扩增结果如图1。质粒送公司测序鉴定，连接框架和准确性均符合要求，说明成功构建了HPV16型E6/E7和HPV18型E6/E7基因表达载体。

图3 A： 免疫酶法检测食管癌血清中HPV相关IgG抗体阳性反应；B： 免疫酶法检测食管癌血清中HPV相关IgG抗体阴性反应Fig.3 A：The positive reaction for IgG in serum by immunoenzymatic method; B： The negative reaction for IgG in serum by immunoenzymatic method

图1 HPV16E6/E7和HPV18E6/E7基因片段扩增电泳鉴定Fig.1 Electrophoresis analysis of HPV16E6/E7 and HPV 18E6/E7 PCR amplified products

2.2 载体在真核细胞中的表达鉴定 由于pSecTag2B载体自带myc标签，myc与HPV16型E6/E7和HPV18型E6/E7形成融合蛋白，用于检测效果较好。通过免疫酶方法，采用抗myc标签蛋白的一抗检测发现在两个转染了重组质粒的HEK293细胞中均有强的棕褐色阳性反应，而且阳性着色细胞比例非常高，而在未转染质粒的HEK293细胞中没有阳性着色反应，如图2，说明在HEK293细胞中有myc标记的融合蛋白的表达。结果表明，在本次实验中真核表达载体构建成功且能在真核细胞中转录、表达。

2.3 免疫酶法检测血清中HPV抗体结果 在所有血清标本中，用该方法只在一例食管癌患者血清中检测到有HPV相关的IgG抗体阳性反应，但阳性着色细胞比例较少，其他血清均没有阳性着色反应，如图3。

2.4 利用病毒样颗粒抗原的ELISA法检测结果 ELISA方法操作简单快速，成本低，可用于大规模血清学普查。本次试验利用ELISA试剂盒对血清进行试验，本试剂盒是利用病毒状颗粒作为抗原，阴性对照孔的OD值为0.002，则临界值为0.152。凡是OD值大于0.152的样品均定为HPV抗体IgG阳性反应。经检测统计，食管癌患者组中抗体IgG阳性反应的有37例，阳性率为48.7%；体检人群中抗体IgG阳性反应的有79例，阳性率为53.0%，见表1。经统计分析食管癌患者和正常体检人群HPV阳性率差异无统计学意义，P>0.05。

表1 ELISA法检测结果Tab.1 Result of ELISA method

3 讨论

有研究表明，部分头颈部肿瘤(食管癌、喉癌、舌癌)及生殖系统肿瘤等的发生与HPV密切相关[5,6]。在不同人群中，经过反复感染或者病毒整合血液中会持续表达相应抗体，这些抗体表达的高低有可能会作为诊断指标，对病毒感染和肿瘤发生进行诊断。HPV血清学检测结果既可提示既往有无感染，也可提示当前有无感染，但是至今HPV很难在体外培养，也无合适的实验动物，对其检测主要依赖于形态学方法和分子生物学技术，且高水平的病毒基因表达都在上皮细胞外面[7]，这些使得HPV血清学发展相对滞后。目前已有研究发现HPV16 E6、E7血清抗体反应与宫颈癌密切相关，HPV16 E6血清抗体有可能成为筛选宫颈癌高危人群的血清学标志[8]。而对头颈部肿瘤中HPV相关抗体检测很少，对相关肿瘤与HPV抗体变化的关系分析更少。

研究发现ELISA与免疫酶法效果相似[2]，但是对于病毒相关肿瘤的诊断ELISA与免疫酶的特异性对不同病毒结果不同。为了探讨血液中HPV相关抗体能否作为食管癌的诊断指标，开展了本次研究。本研究225份血清标本中，使用HPV16型E6/E7和HPV18型E6/E7融合蛋白作抗原的免疫酶法只在一例食管癌血清样本中检测到HPV相应的IgG抗体阳性。此方法灵敏度较低，可能与我们之前检测HPV阳性食管癌患者病毒拷贝数较低，表达较低有关。因此我们认为现阶段的免疫酶法不适合食管癌血清中HPV相关抗体的检测，需要不断地改进提高灵敏度再进行尝试，以期达到理想效果。在以L1作抗原的ELISA法的实验结果中，HPV血清阳性率在食管癌中为48.7%，在体检人群中血清阳性率为53.0%，两者的数据与相关报道基本一致[9]。且患者和正常体检人群之间无明显差异，也不能作为诊断指标。而免疫酶法我们检测发现，比例很低，与ELISA方法检测差距较远。从本实验结果推测HPV在人群中的感染是普遍存在的，并能引起机体免疫反应产生相应的IgG抗体，这种病毒的普遍感染可能对人体健康产生影响，尤其是反复感染时对相应肿瘤的发生可能会有促进作用。但是，本实验的结果显示不能通过HPV IgG抗体血清阳性检测来对食管癌的发生进行诊断，对其他类型抗体需要进一步研究。目前免疫酶法HPV的血清学检测也不能作为食管癌的筛查工具，可能由于食管癌感染HPV拷贝数不高，蛋白表达不高，相应抗体产生滴度较低，因此用免疫酶法检测相关抗体效果不好。而ELISA法即使能检测到IgG抗体血清阳性，但食管癌患者和正常体检人群HPV阳性率无显著性差异，因此也不能作为食管癌的筛查工具。HPV感染的血清学检测用于食管癌的诊断同样有待于进一步的研究，本实验为进一步研究分析食管癌血清中标志物研究作参考。

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(本文编辑：陈培莉)

Detection of HPV antibodies in the serum specimens of esophageal cancer patients in Chaoshan region

Ye Si, Li Jintao, Cai Zhenhai, Wang Yangjunqi, Sara Khodahemmati, Zhao Weijian, Li Hongxia, Zeng Yi

Laboratory of Virology and Pharmocology, College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China (Ye S, Li JT, Wang YJQ, Sara Khodahemmati, Zhao WJ, Zeng Y); People′s Hospital of Jieyang City, Jieyang 522000, China (Cai Zhenhai); State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Beijing 100052, China (Li HX, Zeng Y)

Zeng Yi, Email:zengyicdc1@gmail.com；Li Jingtao, Email:ljt2000593@163.com

Objective To detect the presence of HPV associated antibodies in the serum of patients diagnosed with esophageal cancer in Chaoshan region and to provide data that could possibly be used as reference for the monitoring of patients with esophageal cancer. Methods The pSecTag recombinant vectors containing the HPV16 E6/E7 and HPV18 E6/E7 genes were constructed respectively to express HPV16 E6/E7 and HPV18 E6/E7 fusion proteins in 293 cell line after transfecting the cell line. Immunoenzymatic method was employed with the fusion proteins as antigen to detect IgG antibody against HPV in serum of 76 esophageal cancer patients and 149 normal persons undergoing health checkup. In addition, the same sera were assessed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method using L1 as antigen. Results Only one esophageal cancer patient’s serum presented as positive for IgG by immunoenzyme technique when E6/E7 was used as antigen. However, when the L1 was used as antigen in ELISA assay, 37 of the 76 cases of esophageal cancer patients (48.7%) were HPV antibody-positive. Among the 149 health checkup persons, 79 (53.0%) were HPV antibody-positive. No significant difference was found between the two groups (P>0.05). Conclusion HPV related antibodies in the serum remain inapplicable as a screening tool for serological detection of esophageal cancer. Further research is needed to understand the role and diagnostic applications of HPV infection in esophageal cancer.

Esophageal neoplasms; Papillomavirus human; Enzyme-linked immunosorbent assay

曾毅，Email: zengyicdc1@gmail.com；李劲涛，Email:ljt2000593@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.018

食管肿瘤；乳头瘤状病毒,人；免疫酶法；酶联免疫吸附试验

北京工业大学校级基金(015000514314004)；传染病预防控制国家重点实验室自主研究重点课题(2011SKLID103);北京市自然科技基金面上项目(Z2015001201601)

2016-05-11)