锌离子对人脐静脉内皮细胞的影响

张晓蕾，任岩春，赵永峰，胡喜田，徐雷，安少波，吴志宏

• 论著 •

锌离子对人脐静脉内皮细胞的影响

张晓蕾1，任岩春1，赵永峰1，胡喜田1，徐雷1，安少波1，吴志宏1

目的 探究氯化锌（ZnCl2）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的影响。方法 体外培养HUVECs，氯化锌浓度6～34 μM分别处理细胞，MTS检测生长活性，筛选促细胞增殖的最佳浓度作为实验组浓度。实验组和对照组（未处理）流式细胞术检测HUVECs凋亡情况；鬼笔环肽-异硫氰酸荧光素（FITC）染色检测HUVECs骨架重构；Transwell小室检测HUVECs迁移和侵袭；Real-time PCR检测细胞迁移相关蛋白基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）mRNA相对表达水平；明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9的活性；ELISA法检测HUVECs上清液MMP-2、MMP-9水平。结果 与对照组相比，浓度范围在10～22 μM内ZnCl2处理的细胞，其相对增殖率升高，差异具有统计学意义（P均＜0.05）。选取促进HUVECs增殖的最佳浓度14 μM作为实验组浓度。实验组的HUVECs凋亡率为（12.02 ±0.84）%，高于对照组的（4.05±0.52）%，差异有统计学意义（P＜0.01）。实验组HUVECs细胞迁移个数为（112.20±10.83）个，高于对照组的（94.80±9.50）个，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组HUVECs细胞侵袭个数高于对照组，[（36.20±3.22）个 vs. （32.80±1.07）个]，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组HUVECs细胞迁移相关蛋白MMP-2和MMP-9的mRNA相对表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。实验组细胞迁移相关蛋白MMP-2的光密度值显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组细胞MMP-9的光密度值高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组细胞上清液中MMP-2和MMP-9的吸光度值高于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）。结论 14 μM氯化锌处理HUVECs，使其处于增殖和凋亡平衡的生长活跃状态，并且促进HUVECs骨架重塑和细胞迁移。

锌离子；人脐静脉内皮细胞；增殖；凋亡；迁移

1 材料与方法

1.1 MTS检测细胞生长活性 本研究所用细胞为人脐静脉内皮细胞（HUVECs），购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心，将HUVECs细胞株复苏，在37℃、5%CO2培养箱中培养，当细胞融合80%时，传代。HUVECs用DMEM培养基培养（10%胎牛血清和1%青链霉素）（Gibco，美国），生长密度为90%左右时，进行细胞计数，按实验分组接种于96孔板中，每孔细胞数为5× 103个（n=5），接种后置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，加氯化锌（Sigma-Aldrich 公司，德国）处理，分别加入6 μM、10 μM、14 μM、18 μM、22 μM、26 μM、30 μM、34 μM，对照组未加入氯化锌。将培养板置于培养箱中培养48 h，每孔加入20 μl MTS（Promega，美国），37℃孵育4 h。利用酶标仪（Thermo Scientific，美国）测定波长在490 nm处的OD值，再计算细胞相对增殖率（实验组OD值/对照组OD值×100%）。

1.2 流式细胞术检测细胞凋亡 收集生长密度为90%左右的HUVECs，进行细胞计数，按实验组（14 μM）和对照组将细胞接种于6孔板内，接种密度为4×105个/孔，于37℃、5%CO2培养箱内培养48 h。细胞1500 rpm离心5 min，弃上清，PBS洗涤细胞2次，离心收集细胞，留取约100 μl PBS，每管细胞样品中加入500 μl Binding Buffer使细胞重新悬浮。加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl Propidium Iodide（Cytoskeleton，美国）混匀。在室温下，避光孵育15 min。进行FACS Calibur流式细胞术（BD，美国）检测细胞凋亡。

1.3 Phalloidin-FITC 荧光染色检测细胞骨架重构 氯化锌处理后的实验组和对照组制备细胞爬片，首先用PBS（Hyclone，美国）清洗，再用4%多聚甲醛室温固定5 min，PBS清洗细胞3次，使用Acti-stainTM 488 Fluorescent Phalloidin（Cytoskeleton，美国）孵育玻片1 h，DAPI染核。OLYMPUS BX53荧光共聚焦显微镜（奥林巴斯，日本）在数码相机图像系统（PIXERA PRO600CL，USA）下拍照（×400），并且测量胞外体的长轴、短轴参数，测得长轴/短轴值。

1.4 Transwell小室检测细胞迁移 取生长密度为90%左右的HUVECs，将培养基换为无血清培养基（Gibco，美国），并加入浓度为10 μg/ml的丝裂霉素C处理2 h。PBS清洗3次，0.25%胰蛋白酶消化细胞后，制成单细胞悬液。细胞计数后，加入培养液把细胞稀释成4×104个/ml的细胞悬液以备用。将Transwell小室放到24孔板中，下室加入含20%胎牛血清的培养液800 μl。按实验组和对照组分别取细胞悬液200 μl加入到上室，细胞数均为8000个/孔。将培养板于37℃、5%CO2培养箱中培养48 h。将Transwell小室用PBS清洗1次，在室温下，利用多聚甲醛固定20 min，0.5%结晶紫染色5 min，之后用蒸馏水冲洗干净。对迁移至微孔膜下层的细胞利用OLYMPUS IX51倒置显微镜（奥林巴斯，日本）在CellSens Standard系统下（200×）进行计数。每个样本选取5个视野，取均数。

1.5 Transwell小室检测细胞侵袭 取生长密度为90%左右的HUVECs，将培养基换为无血清培养基（Gibco，美国），并加入浓度为10 μg/ml的丝裂霉素C处理2 h。Matrigel 胶4℃过夜解冻，将Matrigel胶置冰上放入超净台，用无血清培养基将胶按照1：2稀释。取出 Transwell小室放入到24孔板中，用45 μl预先稀释好的Matrigel胶包被小室膜，于培养箱放置2 h使胶凝固。将HUVECs制成单细胞悬液，细胞计数后，加入培养液把细胞稀释成1×105个/ml的细胞悬液备用。将已包被好的Transwell小室放入24孔板中，下室加入含20%的胎牛血清培养液800 μl。按实验组和对照组细胞悬液200 μl分别加入上室，细胞数均为2×104个/孔。37℃、5%CO2细胞培养箱中培养48 h。将Transwell小室用PBS清洗1次，在室温下，利用多聚甲醛固定20 min，0.5%结晶紫染色5 min，之后用蒸馏水冲洗干净。对迁移至微孔膜下层的细胞在OLYMPUS IX51倒置显微镜（奥林巴斯，日本）CellSens Standard系统下（200×）进行计数。每个样本选取5个视野，取均数。

1.6 Real-time PCR检测mRNA水平的表达 按照Trizol试剂说明书提取各组细胞的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，进行荧光定量PCR。基质金属蛋白酶-2（MMP-2）上游引物序列：5′-TGA TCT TGA CCA GAA TAC CAT CGA- 3′，下游引物序列：5′-GGC TTG CGA GGG AAG AAG TT-3′；基质金属蛋白酶-9（MMP-9）上游引物序列：5′-CCT GGA GAC CTG AGA ACC AAT C-3′，下游引物序列：5′-GGC TTG CGA GGG AAG AAG TT-3′；β-actin上游引物序列：5′- CTT AGT TGC GTT ACA CCC TTT CTT G-3′，下游引物序列：5′- CTG TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-3′。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火20 s，72℃延伸60 s。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。所有数据均采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。实验重复3次。

1.7 明胶酶谱法检测MMP-2、MMP-9活性 首先进行蛋白质抽提，将含有1% PMSF的预冷PBS缓冲液加入实验组和对照组的细胞中，并置于冰上，连续吹打细胞。在4℃下进行离心，12 000 rpm离心10 min，收集上清。利用BCA蛋白质定量试剂盒测定浓度。配置分离胶，本次研究所使用的分离胶浓度为10%（含1.0 mg/ml明胶），配置5%浓缩胶，上样量为30 μg。70V恒压冰浴电泳2.5 h。电泳结束后，利用洗脱液将凝胶洗脱 40 min×2次，再利用漂洗液漂洗20 min×2次，在37℃下，将胶放入孵育液中孵育40 h。孵育结束后，用染色液将凝胶染色3 h，再利用脱色液A、B、C分别脱色0.5 h、1 h、2 h。天能Tanon 5500全自动成像分析系统拍照并分析。

1.8 ELISA法检测细胞上清液MMP-2、MMP-9水平 取实验组和对照组培养48 h后的细胞上清液，将上清液稀释20倍，利用ELISA试剂盒（北京达科为生物技术有限公司）检测MMP-2、MMP-9水平。加样、温育、加酶、显色等步骤后，每孔加入5 μl终止液终止反应。使用酶标仪（赛默飞，美国）读取450 nm波长处的OD值。用空白孔调零，绘制标准曲线，横坐标为标准品的浓度，纵坐标为调零后的OD值。

1.9 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTS检测细胞生长活性结果 氯化锌浓度6 ～34 μM分别处理HUVECs，与对照组相比，浓度范围在10～22 μM内的细胞，其相对增殖率升高，差异具有统计学意义（P均＜0.05），高于22 μM出现细胞死亡（图1）。选取促进HUVECs增殖的最佳浓度14 μM，作为后续研究相关指标的实验组浓度。

2.2 流式细胞术检测细胞凋亡结果 实验组的HUVECs凋亡率为（12.02±0.84）%，高于对照组的（4.05±0.52）%，差异有统计学意义（P＜0.01）（图2）。14 μM氯化锌处理的实验组虽然细胞凋亡率高于对照组，但综合MTS实验结果，说明实验组HUVECs处于生长活跃状态。

2.3 HUVECs细胞骨架重构检测 通过荧光显微镜检测HUVECs在对照组和实验组的骨架重构情况，结果显示，实验组的HUVECs长短/短轴比值高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

2.4 Transwell小室细胞迁移检测结果 实验组HUVECs细胞迁移个数为（112.20±10.83）个，高于对照组的（94.80±9.50）个，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4）。

图1 不同浓度锌离子处理组的增殖情况（与对照组比较，aP＜0.05，n=5）

图2 对照组和实验组细胞凋亡情况（与对照组比较，bP＜0.01，n=3）

图3 对照组和实验组细胞骨架成像以及长轴/短轴比值（400×，与对照组比较，aP＜0.05，n=3）

图4 Transwell小室检测HUVECs细胞迁移结果（200×）

2.5 Transwell小室细胞侵袭检测结果 实验组HUVECs细胞侵袭个数为（36.20±3.22）个，对照组为（32.80±1.07）个，实验组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图5）。

2.6 Real-time PCR检测细胞迁移相关基因的相对表达量 实验组细胞迁移相关基因MMP-2和MMP-9的mRNA 相对表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）（图6）。

2.7 细胞迁移相关蛋白活性检测结果 实验组细胞迁移相关蛋白MMP-2的光密度值显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组细胞 MMP-9的光密度值高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图7）。

图5 Transwell小室检测细胞侵袭结果（200×）

图6 对照组和实验组MMP-2、MMP-9 mRNA的相对表达量（与对照组比较，aP＜0.05，n=3）

2.8 细胞上清液MMP-2、MMP-9水平比较 实验组细胞上清液中细胞迁移相关蛋白MMP-2的吸光度值为（74.64±4.15），对照组为（39.99± 3.94），实验组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组MMP-9的吸光度值为（99.37 ±6.20），显著高于对照组的（39.99±3.94），差异有统计学意义（P＜0.05）（图8）。

图7 对照组和实验组细胞迁移相关蛋白活性比较（与对照组比较，aP＜0.05，n=3）

图8 对照组和实验组MMP-2、MMP-9水平比较（与对照组比较，aP＜0.05，n=3）

3 讨论

对于冠心病患者，现在临床上主要的治疗方法是在球囊扩张术的基础上，实施冠状动脉支架置入手术。316L不锈钢金属支架材料、317L不锈钢金属支架材料和L605等[8]钴基合金以及Ti6A14V等钛合金是临床上主要应用的心脏血管支架材料[9]，镍元素作为不锈钢金属支架材料中的重要元素，有一定的致敏性[10]，支架材料中镍离子的释放可以引起血管内皮细胞的过度增殖，造成管壁的再狭窄，成为这种老型支架材料的瓶颈问题。

锌合金是目前研究较多的合金材料，然而，锌合金支架以及镁合金支架材料中的锌离子的确切浓度标准并没有明确，对于人血管内皮细胞的影响也未见相关文献报道。张震等[11]提出Mg-6%Zn合金浸提液能够促进细胞增殖，但是不能排除浸提液中锌离子的影响，本研究分析了锌离子对细胞凋亡的影响。在外周血清中，通过原子吸收法测得正常离子浓度范围11.6～23.0 μM，筛选最佳锌离子浓度，发现14 μM锌离子处理的HUVECs增殖和凋亡处于一个平衡的活跃状态。细胞骨架不仅在维持细胞整体结构，承受外力、保持细胞内部结构方面起重要作用，而且在细胞铺展、迁移和侵袭等方面都发挥了重要作用[12]。本研究结果显示，实验组的HUVECs发生了细胞骨架重构现象。支架置入后，如果表现良好则周围组织的血管内皮细胞爬行到支架表面，因此又检测了HUVECs的细胞迁移和侵袭能力，实验组氯离子干预后能够促进HUVECs的细胞迁移和侵袭。于敏等[13]指出Mg-6%Zn提取液稀释成10%，50%，100%浓度培养L-929细胞，细胞形态学没有差异，这可能是由于离子浓度不同或者是细胞不同所引起的。

MMP是由多种锌离子依赖性酶组成的能降解细胞外基质的重要酶，几乎能降解细胞基质的所有成分，像纤维黏连蛋白、蛋白多糖、黏性蛋白等[14]，细胞侵袭的主要物理屏障是细胞外基质及基底膜。MMPs在细胞侵袭过程中发挥关键的作用[15]。本研究发现实验组能够促进和诱导MMPs的表达并保持较高活性，据本课题组所了解的资料，国内外尚无此类报道。

本研究通过MTS、transwell小室等实验方法，初步探究了锌离子对人血管内皮细胞相关生物学功能的影响，为支架材料的降解和支架置入后再狭窄以及新型可降解锌合金心血管支架材料的开发提供了理论依据。

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本文编辑：姚雪莉

Influence of zinc ion on human umbilical vein endothelial cells

ZHANG Xiao-lei*, REN Yan-chun, ZHAO Yong-feng, HU Xi-tian, XU Lei, AN Shao-bo, WU Zhi-hong.*Department of Cardiovascular Diseases, First Hospital of Shijiazhuang City, Shijiazhuang 050000, China.

Objective To study the influence of zinc chloride (ZnCl2) on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Methods HUVECs were in vitro cultured and treated with ZnCl2respectively in doses from 6 μM to 34 μM. The growth activity was detected by using MTS test for screening the best dose of ZnCl2to promote HUVECs proliferation as test group dose. The apoptosis of HUVECs was detected by using flow cytometry in test group and control group (without ZnCl2treating). The cytoskeleton remodeling of HUVECs was detected after FITCPhalloidine staining. The migration and invasiveness of HUVECs were detected by using Transwell chamber test. The relative expressions of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) mRNA and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) mRNA were detected by using real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR). The activities of MMP-2 and MMP-9 were detected by using gelatin zymography. The levels of MMP-2 and MMP-9 in HUVECs supernatant were detected by using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results The relative growth rate (RGR) of HUVECs treated with ZnCl2in doses from 10 μM to 22 increased in test group compared with control group (all P<0.05). The best dose of ZnCl2(14 μM) to promote HUVECs proliferation was chosen as test group dose. The apoptosis rate of HUVECs was (12.02±0.84)% in test group and (4.05±0.52)% in control group (P<0.01). The migration numbers of HUVECs were (112.20±10.83) in test group and (94.80±9.50) in control group (P<0.05). The invasiveness numbers of HUVECs were higher in test group than those in control group [(36.20±3.22) vs. (32.80±1.07), P<0.05]. The expressions of MMP-2 mRNA and MMP-9 mRNA of HUVECs were higher in test group than those in control group (all P<0.05). The optical density (OD) value of MMP-2 was significantly higher in test group than that in control group (P<0.05). The OD value of MMP-9 was higher in test group than that in control group (P<0.05). The absorbance values of MMP-2 and MMP-9 in HUVECs supernatant were higher in test group than those in control group (all P<0.05). Conclusion HUVECs, treated with ZnCl2(14 μM), are in an active statement of growth with the balance of proliferation and apoptosis, and their cytoskeleton remodeling and migration are promoted.

Zinc ion; Human umbilical vein endothelial cells; Proliferation; Apoptosis; Migration冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是由于冠状动脉血管血小板、炎症因子聚集[1]，导致的粥样硬化病变，管腔狭窄，造成心肌缺血、缺氧[2]。冠状动脉介入治疗已成为冠心病的主要治疗手段[3]，但是目前应用最广泛的是以316L和317L为主的不锈钢金属支架，在成功置入支架后部分患者会发生管腔再狭窄[4]。因此研发新型支架材料，对于治疗冠心病具有重要的临床意义。锌合金为新型血管支架材料研发提供了新思路。锌是人体必需元素，易被人体吸收，无毒副作用[5]。锌还是蛋白质、核酸合成酶的成分，是上百种酶的活性中心，能促进细胞更新[6]。锌元素可以添加到镁合金中，对镁合金有固溶强化和时效强化的双重功效，能够提高镁合金的力学性能[7]。锌镁合金作为新型可降解金属支架材料，能够释放镁离子和锌离子，与氯离子共存时，更易发生腐蚀，并在体内以缓慢腐蚀的方式完全降解，其产物对人体无毒、无害，且参与人体正常代谢。然而锌离子对人血管内皮细胞生物学功能的影响尚不清楚。本研究通过MTS实验、流式细胞术、Transwell小室、Real-time PCR、明胶酶谱、ELISA等方法，分析锌离子对人血管内皮细胞增殖、凋亡等影响，旨在为临床支架研发和置入提供依据。

R543.6

A

1674-4055(2017)06-0677-05

石家庄市科技计划(141462823)

1050000 石家庄,石家庄市第一医院心血管内科

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.06.10