大黄主要蒽醌类成分的闪式提取及HPLC检测

李智平，刘发生，田青平，韩利文，刘可春，张爱平

1.山西医科大学药学院，山西太原 030001；2.山东科学院生物研究所（山东省科学院药物筛选技术重点实验室），山东济南250014

大黄主要蒽醌类成分的闪式提取及HPLC检测

李智平1,2，刘发生1,2，田青平1，韩利文2，刘可春2，张爱平1

1.山西医科大学药学院，山西太原 030001；2.山东科学院生物研究所（山东省科学院药物筛选技术重点实验室），山东济南250014

目的建立简便的闪式提取法提取中药大黄中蒽醌类成分，并用HPLC法测定其中5种主要游离蒽醌的含量，为大黄蒽醌类化合物高效提取和工业生产提供依据。方法建立闪式提取法提取大黄中蒽醌类成分，与常规的回流提取法进行比较研究，采用C18色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸为流动相，梯度洗脱，建立HPLC检测方法，同时检测五种蒽醌的含量，并比较两种方法的提取效率。结果建立的HPLC法能够同时检测5种蒽醌成分，方法准确、可靠。与回流提取方法比较，闪式提取法在短时间内可以达到相近的提取率，显示了闪式提取大黄蒽醌类化合物的优势。结论在相同实验条件下，闪式提取法显示了快速简便、节能高效的特点，可为大黄蒽醌类有效成分成分的高效提取和工业生产提供理论依据。

大黄；蒽醌；闪式提取；HPLC；回流提取

大黄有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经及利湿退黄的功效[1]。大黄中提取分离得到的最主要的活性成分是蒽醌及其苷类等[2]。大黄的提取方法文献已经有很多报道，各种方法对大黄中蒽醌类成分的提取率都有不同的影响。传统煎煮法提取由于受热时间过长，大黄蒽醌成分的提取率会降低，同时受热会破坏物质的结构，从而使其活性减弱[3]。热回流法提法一般需要多次回流[4]，工艺过程相对复杂，提取还需用到有毒害危险的化学试剂，如氯仿，乙醚等，限制了其在提取生产中的实际应用。超声法提取大黄粉末的粒度要求高[5]，也存在耗时长的问题。闪式提取是一种新型的提取技术，在短时间内即可实现对目标成分的快速提取[6]。该实验建立了闪式提取法对大黄蒽醌类成分进行提取，并与回流提取进行比较研究，为大黄蒽醌类成分的高效提取和工业生产提供理论指导依据。

1 仪器和试药

主要设备：闪式提取器（河南金鼐科技发展有限公司）。旋转蒸发仪（日本东京理化），真空干燥箱（上海博讯实业有限公司），高效液相色谱仪(日本日立公司)。

对照品：大黄素，大黄酚，大黄酸，芦荟大黄素和大黄素甲醚购于中国药品生物制品检定所，纯度均＞98%。一般试剂：磷酸，乙醇、甲醇为市售分析纯。大黄药材购于济南市建联中药店，由山东省科学院生物研究所刘可春研究员鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：迪马C18色谱柱，以乙腈(A)－0.1%磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～10 min，52%A；10～25 min，52%～82%A；25～30 min，82%～90%A；30～35 min，90%A)，流速：1mL/min，室温，进样量：10μL，检测波长：254 nm。 此条件下，样品中的目标物质都得到充分的分离。

2.2 大黄粉末的提取

闪式提取：干燥的大黄药材粉碎，过4号筛，称取粉末5.0 g，准确称量，加入70%乙醇500 mL，放置在闪式提取仪上室温提取1 min，提取功率为120 W，提取完毕后，平行进行3次，减压过滤，浓缩干燥即得大黄提取物。

回流提取：取4号筛大黄药材粉碎，精密称取粉末5.0 g 3份，加入70%乙醇500 mL，置于回流装置上85℃回流60 min，提取完毕后，减压过滤，浓缩干燥，即得大黄提取物干燥物。

2.3 样品溶液制备

2.3.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取2 mg左右五种对照标准品，加入甲醇溶解并定容到10 mL的容量瓶，分别配成对照品储备母液，0.22 μm微孔过滤后储存于4℃的冰箱中，备用。

2.3.2 供试溶液的制备 分别取的两种提取方法得到大黄干燥提取物100 mg左右，精确称量，用甲醇溶解，置于25 mL容量瓶中定容，用0.22 μm微孔滤膜过滤后，即得两种样品供试溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 精密吸取“2.3.1”制得混合对照品溶液，按照“2.1”的条件，连续进样5针。分别测定得到各单体的峰面积，计算各成分5次的RSD。结果显示，5种成分峰面积的精密度RSD分别为1.0%、0.3%、0.8%、1.3%、1.4%。

2.4.2 线性关系和线性范围考察 将对照标准品混合储备液用甲醇分别配制成个不同浓度梯度，再调整进样量。依次得到五种单体的不同进样含量峰面积，根据各成分含量与峰面积的关系，得到芦荟大黄素（y=113.51x+8264），大黄酸（y=120.86x+25 111），大黄素（y=121.58x+158 76），大黄酚（y=177.2x+18995）和大黄素甲醚（y=19.601x+1 181.7）的线性回归方程，回归系数R都大于0.999，线性范围在100～1 000 ng之间。

2.4.3 重复性实验 称取大黄闪式得到的干燥提取物5份，按照“2.3.2”项下方法分别制备成样品供试品溶液，依次进样检测，依次得到五种单体成分的峰面积，计算每种成分的RSD。结果显示，5种成分RSD%分别为1.5%、2.3%、2.0%、2.1%、2.3%。

2.4.4 加样回收率实验 取6份干燥提取样品适量，分别精密加入对照品贮备液，设置低、高2个不同浓度，甲醇定容，再0.22 μm微孔滤膜过滤得到供试溶液，同时在上述色谱条件下测定，计算供试样中五种蒽醌类化合物的回收率以及RSD值。五种单体的平均回收率(n=6)的结果分别为 102.1%、98.4%、101.9%、102.0%、98.7%，RSD 分别为1.8%、2.0%、1.7%、1.8%、2.2%。

2.5 大黄闪式提取样品的测定

取“2.2”项下两种方法制备得到的各3份提取物，按照“2.3.2”项下方法制备供试溶液。两种方法得到的供试溶液依次“2.1”色谱条件进行实验检测。在上述色谱条件下测定5种成分的峰面积，结果显示，五种物质都在线性回归方程的应用范围内，可以代入线性回归方程，并计算3次检测含量，得到3次的均值。结果见表1。

表1 不同提取方法中5种蒽醌成分含量比较（n=3）

3 讨论

闪式提取法是一种新型的提取方法，其依靠机械剪切力快速破碎，剧烈搅拌，超速动态分子渗滤作用，强力振动作用，从而加速物质溶出[6]。在室温及溶剂存在下数秒钟内能够将药材的组织粉末物料进一步破碎至细微颗粒，并使有效成分迅速溶于溶剂中，提取时间一般在几分钟内即可完成，比传统提取方法快速、简便、完全、高效，且具有溶剂用量小特点，适用于工业化生产[7]。

该实验建立了用于同时检测大黄提取物中5种蒽醌含量的HPLC方法，对游离蒽醌分离效果好，其他成分对检测不造成干扰。HPLC检测方法学通过精密度、稳定性、重复性、回收率验证结果显示，HPLC法对蒽醌类成分含量检测的适用性良好，可用于检测大黄蒽醌类物质的含量。

该实验考察了闪式提取法和常规的回流提取法对大黄中5种蒽醌类成分的提取率的差别。回流提取法是参考中国药典2015版中对大黄蒽醌类提取方法，该法得到大黄蒽醌类提取率相对可靠。结果显示，闪式提取在1 min左右的提取效率基本与回流提取用60 min提取效率相当，同时具有节能的优点，显示了明显优势，适合于工业生产。所以，在该实验条件下，闪式提取在提取大黄蒽醌类成分方面显示了一定的优势，适合放大生产，这些结果为大黄蒽醌类有效成分成分的高效提取和工业生产提供理论依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部[S].北京:中国医药科技出版社,2015:23.

[2]徐翔,郦柏平,张慧芬．大黄的研究进展[J].上海中医药杂志,2003,37(4):56-59.

[3]苏子仁,周华,刘中秋.大黄在提取精制工艺中的化学变化研究[J].药物分析杂志,1998,18(2):83-84.

[4]程磊,杨骏,郭静.大黄蒽醌提取工艺研究[J].上海中医药杂志,2012,46(2):71-73.

[5]金波,李薇,蔡伟.大黄总蒽醌提取与纯化工艺的研究[J].时珍国医国药,2005,16(8):756-757.

[6]武新安,魏玉辉,沈明谦,等.大黄粉末中葱醒类成分提取方法比较[J].兰州大学学报，2006,32(4):38-40.

[7]刘翠哲,刘喜纲,王汝兴.大黄中总蒽醌的提取工艺研究进展[J].2004,16(4):40-42.

[6]刘延泽.植物组织破碎提取法及闪式提取器的创制与实践[J].中国天然药物,2007,5(6):401-407.

[7]李霞,李巍,张化,等.HPLC测定3种甘草废渣中光甘草定的含量[J].中国现代中药,2011,6(13):24-26.

Flash Extraction and HPLC Test of Anthraquinones Component of Rhubarb

LI Zhi-ping1,2,LIU Fa-sheng1,2,TIAN Qing-ping1,HAN Li-wen2,LIU Ke-chun2,ZHANG Ai-ping1
1.College of Pharmacy of Shanxi Medical College,Taiyuan,Shanxi Province,030001 China;2.Biological Research Institute of Shandong Academy of Sciences&Key Laboratory of Drug Screening Technology of Shandong Academy of Sciences,Jinan,Shandong Province,250014 China

ObjectiveTo establish a simple flash extraction to extract the anthraquinones component of rhubarb and the content of 5 kinds of main free anthraquinones was measured by the HPLC method thus providing basis for the effective extraction and industrial production of anthraquinones component of rhubarb.MethodsThe anthraquinones component of rhubarb was extracted by the flash extraction,and compared with the routine reflux extraction,and the C18 chromatographic column was used and the acetonitrile-0.1%phosphoric acid was used as the mobile phase and the content of five kinds of anthraquinones was tested by the HPLC test method and the extraction effect was compared.ResultsFive kinds of anthraquinones could be tested by the HPLC,and the method was accurate and reliable,and the flash extraction could reach the similar extraction rate in a short time,which showed that the advantages of it in extraction of rhubarb anthraquinone analogues.ConclusionThe flash extraction is rapid,simple,energy-saving and effective under the same experimental conditions,which can provide theoretical basis for the effective extraction and industrial production of anthraquinones component of rhubarb.

Dahuang;Anthraquinone;Flash extraction;HPLC;Reflux extraction

R2

A

1672-5654（2017）06（a）-0121-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.16.121

2017-03-01）

山东省自主创新及成果转化专项（2014ZZCX02105），山东省重点研发计划项目（2016GSF121009）。

刘智平（1989-）,男，湖南邵阳人，硕士，研究方向：药剂学。