克罗恩病患者蛋白质组学差异表达的研究

张旭华

（江西省吉安市井冈山大学附属医院普外科，江西吉安343000）

克罗恩病患者蛋白质组学差异表达的研究

张旭华

（江西省吉安市井冈山大学附属医院普外科，江西吉安343000）

目的探讨克罗恩病患者血清中的差异表达蛋白。方法选取在本院诊治的克罗恩病患者20例，采用各种CyDve染料实施交叉标记后，依据顺序实施MALDI-TOF-MS、2-D DIGE等鉴定操作。结果对二者双向电泳图对比，发现克罗恩病患者在表达异常蛋白质点方面有多个，其中1 058蛋白质点，相比于正常成人组，则存在明显升高，即1.67倍（P＜0.05），此蛋白质通过质谱鉴定得知，乃是一种结合珠蛋白质。结论在克罗恩病血清中，结合珠蛋白所存在的高表达，提示在其病程中免疫系统失衡可能存在一定作用。

克罗恩病；蛋白质组学；结合珠蛋白

克罗恩病（CD）乃是一种尚不能明确病因的非特异性且为慢性的肠道炎性疾病。血清中蛋白质成分丰富，而在不同疾病状态下，其结构及丰度也会存在相应差异。在血清当中找寻各种与疾病相关的分子标记物，有助于疾病早期诊断[1]。双向差异凝胶电泳（2-D DIGE）乃是一种新发展和应用的蛋白质组学新技术，提灵敏性和可重复性更高[2]。本次研究选取2014年3月～2016年10月在本院诊治的克罗恩病患者20例，采用2-D DIGE对其血清中的蛋白质予以研究，找寻此病当中相应差异表达蛋白质。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2014年3月～2016年10月在本院诊治的克罗恩病患者20例，另选取同期正常成人血清蛋白样本20例，依据经改良后Mendeloff标准实施诊断。两组在1个月内均未曾采用免疫抑制剂及皮质激素予以治疗。抽取5 mL空腹静脉血，放置室温下，持续20 min，离心机分离因子3 000 g，并于4℃下实施离心，持续10 min，选取上层血清标本，将其分别装入EP管，各管量为100µL，并保存与冰箱中，温度维持-80℃。选用由瑞典Amershem Bioscience公司生产的EttanTM MALDI-TOF质谱仪，Deep Purple全蛋白染料，Ettan TM DALT6电泳仪；采用美国Sigma生产的PROT-BA Kit，运用瑞典GE Healthcare生产的2-D Clean-up Kit。

1.2CyDye染料标记与样品蛋白的纯化、处理采用2-D Clean-up Kit及PROT-BA Kit试剂盒，将血清标本当中诸如球蛋白及白蛋白等高丰度蛋白予以去除。蛋白重悬于pH 8.5缓冲液中，由样品蛋白质个抽取3.12µg混合而成内部标准标本，总剂量50µg，采用特殊材质的三种荧光材料，分别为Cy5、Cy3和Cy2，以50µg蛋白，即采用200 pmol荧光染料，实施标记反应[3-4]。于无光及冰浴环境下，实施标记，时间为30 min，而后将20 mmol/L赖氨酸加入其中，持续冰浴操作，延长10 min，而后将标记反应予以终止。

1.3 双向差异凝胶电泳依据Amersham Ettan DIGE操作标准，将样品蛋白自上样至PH3-1024cm非线性IPG胶条标记，将其放置于EttanTM DALT6内，实施第一向电泳，逐步增加伏特，当增加至65 000 Vh则可停止。而后将内部含有碘乙酰胺25 g/L及10 g/L二硫苏糖醇的SDS平衡液，针对IPG胶条实施平衡操作，时间均为15 min。当IPG胶条完成平衡后，将其放置于125 g/L相应聚丙烯酰胺胶上部，开始第二向电泳操作，各张胶均保持恒定功率，即2.5 W，持续时间40 min。调整各张胶电泳，即17 W，当出现溴酚蓝向胶外移动则可停止。

1.4 分析胶成像及图像分析采用Typhoon Imager 9400成像仪，图像扫描上述采用CyDye予以染色的分析胶板，Cy2为487 nm波长激光扫描，Cy3为531 nm波长激光扫描，Cy5为632 nm波长激光扫描，采用DeCyder6.0软件完成处理操作后，得图像颜色分别为蓝色、绿色和红色。将全部的Cy2图像，均设置成内标图像，而将那些具有最多蛋白质点数的胶，设定为参考胶，而其它胶则与其形成匹配，对于所得出的匹配点，开展后续分析。将蛋白质体积作为指标，当电梯及图像小于1.0×e 5蛋白质点，则表明其为太小的蛋白质点不纳入差异分析，而若为1.0×e 8，则为太大，也不纳入差异分析，采用DeCyder6.0分析软件实施Decye焦内分析，将差异表达蛋白点（index，ID）找寻，完成差异目录（pick，list）编制，差异比值设定为大于1.5倍[5]。

1.5 制备胶Deep Purple蛋白染色各组样品蛋白质含有同等量的样品共500µg，将其加样至制备胶，实施电泳，采用Deep Purple实施全蛋白染色。步骤为：把胶放置于固定液中（醋酸70 mL/L，甲醇95 mL/L），当完成双蒸水漂洗操作后，放置于1/200 Deep Purple染色液中；在摇床上颜色，持续1 h，最后，于信号固定液中实施漂洗，时间大于25 min，采用Typhoon Imager9400成像仪实施成像操作，采用532 nm激光实施扫描操作。

1.6MALDI TOF-MS把分析胶差异表达的蛋白质，匹配与制备胶，并且，在制备胶上，将具体位置的蛋白点予以找出，采用RttanTM全自动斑点处理工作站，实施干燥、脱色除盐及切点操作，当完成这些步骤之后，将样品放置于RttanTMMALDI-TOF质谱仪之中，将阐述予以设定，开展质谱分析操作，至此，便可将肽指纹图谱予以获取。检索目标设置为差异点的肽指纹图谱，另外，采用MALDL EVALUATION V2.0软件实施检索操作[6]。

1.7 统计学方法采用DeCyder V6.0软件，实施胶内差异分析操作（DIA），另行生物学差异分析（CVA），采用t行检验。

2 结果

2.1 分析胶成像通过双向差异电泳后，在全部胶条中，都可获取清晰蛋白质达谱，然后采用DeCyder软件实施处理，由于采用不同染料实施标记的样本，其图谱也呈现出不同颜色，抽取其中任意一张开展分析，经过融合而最终形成，蓝色图谱所表示的是内标，标记为Cy2；绿色的图谱则表示为正常成人的血清蛋白，标记为Cy3；红色的则为CD患者的血清蛋白，标记为Cy5。见图1。

2.2 图像质谱分析采用DeCyder软件实施分析，CD患者相比于正常成人血清当中差异点，共计29个，其中差异表达1.5倍上为25个（P＜0.05）；见图2。胶号乃是1 055的蛋白质点，则在CD患者血清中，相比于正常成人组，高出1.67倍，P=4.29，E-08。见图3。EttanTM MALDI-TOF质谱仪实施分析操作后，获取肽指纹图谱。见图4。将肽段在NCBInr数据库中输入，并搜索，最终确定为结合珠蛋白（Hp）。

图1 双向差异凝胶电泳图像

图2 CD患者2-DE凝胶电泳图，编号标记为差异表达的蛋白质斑点

图3 1055编号差异表达蛋白质的电泳图

图4 Hp肽指纹图谱

3 讨论

蛋白质组学研究了基因表达的成熟形式，乃是基因转录实施研究之后，一种最为有利的提升及补充。近些年来，蛋白质组学诸多技术均得到较大幅度提升及发展，对于传统的双向电泳技术而言，其灵敏度差，不能对低丰度的蛋白质实施检测，并且各块胶仅可以完成2个样品的分离，另外，人为因素所造成的影响，依据造成胶之间存在较大差异，还具有较差的实验室之间的可重复性。2-D DIGE采用的是一组具有特殊性的CyDYE DIGE荧光染料，能够对低丰度的探测灵敏度给予显著提升，此外，对于相同胶上，将三种不同染料的标记蛋白实施分离，经实验样本当中提取量相等的样本很合，进而为各个胶构建共同的内部标准样本，也就是内标，经相同凝胶内样品图像相比于与内标图像，针对各种凝胶内标图像之间开展比较，主要有两步骤，可将胶之间的差异予以消除，进而获取样品之间蛋白表达的实际差异，对于操作者间所存在的偏差最大限度的予以降低，进而将假阳性及假阴性予以大幅减少，乃是当前一种具有高准确率及可信度的技术。

[1]廖诗乐,陈白莉,胡坤华,等.英夫利西单抗治疗克罗恩病黏膜愈合的血清差异蛋白质表达研究[J].中国病理生理杂志, 2015,31(5):894-899.

[2]康亮,杨祖立,王磊,等.CD45在克罗恩病患者血清中的表达[J].南方医科大学学报,2009,29(2):259-263.

[3]陆晓春,韩树堂.肠内营养疗法在克罗恩病临床治疗中的应用进展[J].当代医学,2012,18(15):26-28.

[4]庞智.蛋白质组学在炎症性肠病分子机制研究中的应用前景[J].胃肠病学,2005,10(2):113-115.

[5]苏丽,李楠.蛋白质组学技术在炎症性肠病研究中的应用研究进展[J].中华消化病与影像杂志:电子版,2012,2(3):32-35.

[6]童明霞,缪应雷.蛋白质组学在炎症性肠病研究中的应用[J].世界华人消化杂志,2010(22):2333-2338.

[7]周强,张言斌,汤春梅,等.克罗恩病与肠结核鉴别诊断对比分析[J].当代医学,2009,15(6):38-39.

[8]翟宝进,刘欣民,李双英,等.颅内动脉瘤患者血清差异表达蛋白质的研究[J].中华神经外科杂志，2010,26(10):891-895.

Proteomic differential expression in patients with Crohn's disease

Zhang Xu-hua
（Department of general surgery，Affiliated Hospital of Jinggangshan University of Jiangxi;Ji'an，Jiangxi，343000，China）

ObjectiveTo investigate the differences in serum of patients with Crohn disease protein.Methods20 cases in our hospital for treatment of Crohn's disease patients,the implementation of cross labeled by various CyDve dyes,the implementation of MALDI-TOF-MS based on2-D DIGE sequence identification operation.Results Of the two dimensional electrophoresis map comparison,found that patients with Crohn's disease the abnormal expression of protein spots are multiple,including 1 058 protein spots,compared to the normal adult group,there is increased 1.67 times(P<0.05),the protein identification by mass spectrometry that is a combination of pearl protein in serum.ConclusionHigh expression of Crohn's disease,combined with the existing pearl protein,suggesting that in the course of immune system imbalance may have some effect.

Krohn's disease;Proteomics;Protein binding

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.20.077