柚皮素预处理对心肌缺血/再灌注损伤大鼠能量代谢的影响

骞秀芳，郭 喆，胡常菊，刘 丹，张国斌



柚皮素预处理对心肌缺血/再灌注损伤大鼠能量代谢的影响

骞秀芳1，郭 喆1，胡常菊1，刘 丹1，张国斌2

目的 探讨柚皮素预处理对心肌缺血/再灌注损伤大鼠能量代谢的影响。方法 将大鼠随机分为5组(n=10)：假手术组、模型组，柚皮素分为三个剂量组(100、50、25 mg/kg)，于建立模型前7 d开始腹腔注射给药，通过结扎冠脉30 min再灌注2 h建立心肌缺血/再灌注损伤模型；再灌注结束后，采用比色法测定血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性，采用定磷法测定心肌组织Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力，采用染色法测定心肌梗死面积(myocardial infarction surface, MIS)。结果 柚皮素高剂量组MIS缩小至32.91%，与模型组MIS(39.78%)比较差异有统计学意义(P<0.05)；柚皮素各剂量组CK活性分别降低为658.03、650.12、621.89 U/L，与模型组(809.45 U/L)比较，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；各剂量组LDH活性分别降低为1543.08、1506.27、1326.97 U/L，与模型组(2034.56 U/L)比较差异均有统计学意义(P<0.05或P< 0.01)；柚皮素各剂量组可显著升高Na+/K+-ATP酶活力为6.82、6.83、6.94 mmol Pi/(g·h)，与模型组[5.54 mmol Pi/(g·h)]比较差异均有统计学意义(P<0.05)；高、中剂量组可显著升高，Ca2+/Mg2+-ATP酶活力为8.42、8.97 mmol Pi/(g·h)，与模型组[7.06 mmol Pi/(g·h)]比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 柚皮素预处理对心肌缺血/再灌注所致心肌损伤的保护作用可能与改善心肌组织的能量代谢有关。

柚皮素；心肌缺血/再灌注损伤；大鼠；能量代谢

柚皮素(naringenin)主要存在于枳实、菝葜、化橘红等植物中，属类黄酮类化合物。柚皮素具有多种生物学活性，目前已有报道的如降血脂、降血糖、抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等[1, 2]。近年来研究发现，柚皮素对实验动物的心肌细胞损伤具有保护作用[3-5]。本研究应用心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion)损伤大鼠模型，探讨柚皮素保护心肌的作用机制是否与能量代谢有关。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 柚皮素(纯度98%)购自Sigma公司，试验前用1% DMSO配制所需浓度。肌酸激酶(CK)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、ATP酶试剂盒、考马斯亮蓝试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物 SD大鼠，雌雄各半，体重180～220 g，购自河北医科大学实验动物中心，合格证号：SCXK(冀)2008-1-003。

1.3 方法

1.3.1 建立心肌缺血/再灌注大鼠模型 采用冠脉结扎术，参照文献[6]方法进行。简言之，将麻醉后的大鼠仰位固定，四肢连接十二导联心电图机(日本光电工业株式会社产品，型号ECG-1350P)。颈部做气管插管，连接小动物人工呼吸机(安徽正华生物仪器设备有限公司，型号DW-3000)，设为呼吸频率60次/min，潮气量20 ml/kg。于胸骨左旁第3肋和第4肋间开胸，用丝线撑开肋骨，暴露心脏，沿左心耳下缘冠脉前降支起始部约4 mm处用带线缝合针进针，深度控制在约1 mm，将一小段直径1.5 mm的乳胶管置于缝合线下，之后结扎缝合线致大鼠心肌缺血。缺血30 min左右观察到心电图ST段明显抬高或T波高耸后，松开缝合线再灌注2 h(观察到心电图抬高的ST段下降1/2以上或高耸的T波下降，视为再灌注成功)。

1.3.2 分组与给药 将大鼠随机分为：假手术组(等体积溶媒)、模型组(等体积溶媒)、柚皮素高剂量组(100 mg/kg)、柚皮素中剂量组(50 mg/kg)、柚皮素低剂量组(25 mg/kg)，于术前7 d开始腹腔注射给药，每天1次。假手术组10只大鼠仅开胸不结扎冠脉，其他各组则每组均抽取术后成模大鼠10只进行后续试验。

1.3.3 测定血清心肌酶活性 再灌注结束后，动物经腹主动脉采血，常规2500 r/min离心10 min分离血清，采用比色法分别于紫外/可见分光光度计(日本岛津公司，型号UV-2550)660 nm和440 nm下测定OD值，并计算CK、LDH活性，严格按试剂盒说明书操作。

1.3.4 测定心肌ATP酶活力 采血后，各组取部分心脏，生理盐水洗净血迹，用组织匀浆机(德国IKA集团，型号T10)制成匀浆，3500 r/min离心10 min得上清。采用定磷法于紫外/可见分光光度计660 nm下测定OD值，并计算ATP酶活力；心肌匀浆上清液的蛋白浓度采用考马斯亮蓝法定量，严格按试剂盒说明书操作，酶活力单位[mmol Pi(g·h)]以每小时每克组织蛋白产生的无机磷(Pi)含量表示。

1.3.5 测定心肌梗死面积(MIS) 各组取心脏，用生理盐水洗后，去除血管、脂肪及心房组织，从冠脉结扎线下方至心尖处将心室平行切成厚度相等的5片，置于0.1% NBT溶液中，37 ℃染色15 min。以数码相机采集图像(正常心肌呈蓝色，梗死心肌则呈灰白色)，采用Image Pro Plus 7.0软件测算心室总面积和梗死区面积，并计算MIS(%)[7]。

2 结 果

2.1 MIS情况 模型组动物MIS达39.78%，柚皮素预处理可缩小MIS，其中高剂量组的MIS缩小至32.91%，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。假手术组因未出现心肌梗死，MIS未纳入统计学比较(图1)。

图1 柚皮素预处理对心肌缺血/再灌注损伤大鼠MIS影响 与模型组比较，①P<0.05

2.2 心肌酶活性情况 假手术组动物血清CK、LDH活性分别为179.30、596.90 U/L，模型组动物血清CK、LDH活性显著升高，与假手术组比较组间差异均有统计学意义(P<0.01)；柚皮素预处理低、中、高剂量组CK、LDH活性，与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01，图2)。

图2 柚皮素预处理对心肌缺血/再灌注损伤 大鼠血清CK和LDH活性影响

与假手术组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.05，③P<0.01

2.3 ATP酶活力情况 假手术组动物心肌组织Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力分别为7.26、9.23 mmol Pi/(g·h)，模型组动物心肌组织Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶的活力分别显著降低为5.54、7.06 mmol Pi/(g·h)，与假手术组比较组间差异均有统计学意义(P<0.01)；柚皮素预处理可不同程度地影响ATP酶活力，与模型组比较，高、中剂量组可升高Ca2+/Mg2+-ATP酶活力(P<0.05)，高、中、低剂量组可升高Na+/K+-ATP酶活力，差异均有统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 柚皮素预处理对心肌缺血/再灌注损伤 大鼠心肌组织ATP酶活力比较 与假手术组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.05

3 讨 论

采用药物预处理的方式可促使机体释放生物活性物质或直接激活机体自身保护机制，进而增强心肌缺血/再灌注损伤心肌组织对缺血、缺氧的耐受，实现心肌保护作用[8]。本研究观察了柚皮素预处理对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用，结果显示柚皮素通过预处理给药能显著缩小心肌梗死面积，这与梅繁勃等[5]的报道结果一致。

当心肌缺血/再灌注发生导致心肌细胞膜受损时，心肌细胞中的蛋白酶CK和LDH外漏增加，其释放入血的量与心肌坏死程度呈正相关[9]。本研究结果显示，模型组动物血清CK和LDH活性显著升高，反映出心肌缺血/再灌注心肌细胞损伤的程度；柚皮素预处理可显著降低血清CK和LDH活性，提示柚皮素可通过提高细胞膜的稳定性而保护受损的心肌组织。

能量代谢是心肌细胞活动的物质基础，目前认为能量代谢障碍是心肌缺血/再灌注损伤的始动环节和损伤进一步加重的原因之一[10]，ATP酶活力则可反映细胞的能量水平，在缺血性心脏病的研究中受到重视。心肌缺血/再灌注发生时，线粒体受损，ATP生成减少，使心肌细胞膜和肌浆网上Na+/K+-ATP酶活力降低，导致心肌细胞内Na+浓度升高和酸中毒，通过Na+-H+交换使细胞内Na+进一步增多，Na+超负荷会激活细胞膜上的Na+-Ca2+交换蛋白，使Ca2+内流增多；同时肌浆网上Ca2+/Mg2+-ATP酶活力降低，胞内Ca2+摄取减少造成细胞内外Ca2+和Mg2+分布失衡，更加重了细胞内钙超载[11]。钙超载则会触发一系列的细胞损伤机制如加重线粒体损伤进而加重心肌细胞的能量缺乏，激活磷脂酶使细胞膜结构受损，激活蛋白水解酶进而引起迟发性细胞死亡等[12]。本研究结果显示，心肌缺血30 min再灌注2 h后，心肌组织中Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力显著降低，说明此时心肌出现能量代谢障碍，细胞功能受抑；柚皮素预处理则可明显提高心肌组织中Na+/K+-ATP酶和Ca2+/Mg2+-ATP酶活力，进而调节细胞内外离子平衡尤其是Ca2+稳态，改善心肌组织的能量代谢障碍。

综上所述，柚皮素预处理对心肌缺血/再灌注损伤的心肌保护作用是通过保护细胞膜ATP酶活力、改善能量代谢等途径实现的；至于柚皮素具体作用于能量代谢的哪个环节，尚需进一步研究。

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(2017-01-09收稿 2017-03-08修回)

(责任编辑 武建虎)

Effect of naringenin on energy metabolism in rats with myocardial ischemia/reperfusion injury

QIAN Xiufang1, GUO Zhe1, HU Changju1, LIU Dan1，and ZHANG Guobin2.

1.Department of Pharmacy, the Second Hospital of Beijing Municipal Corps, Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100027, China; 2. Pharmacy College, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China

Objective To investigate the effect of naringenin on energy metabolism in rats with myocardial ischemia/reperfusion injury.Methods SD rats were divided randomly into sham group, model group, naringenin low dose group (25 mg/kg), naringenin medium dose group (50 mg/kg) and naringenin high dose group (100 mg/kg) (n=10). Naringenin was intraperitoneally injected once a day for 7 days before the modeling operation. A myocardial ischemia/reperfusion injury model was established by coronary artery ligation (30 min) and subsequent reperfusion (2 hours) in rats. After the modeling operation, the CK and LDH activities in sera were examined by chromatometry, Na+/K+-ATPase and Ca2+/Mg2+-ATPase activities in brain tissues were detected by phosphorus method and the myocardial infarction size (MIS) was determined by staining method.Results A high dose of naringenin significantly reduced MIS to 32.91% compared to 39.78% of model group (P<0.05). The CK activities in naringenin groups were 658.03, 650.12 and 621.89 U/L, respectively, which were significantly lower than 809.45 U/L of model group (P<0.05 orP<0.01). Naringenin significantly reduced LDH activities to 1543.08, 1506.27 and 1326.97 U/L, respectively, compared to 2034.56 U/L of model group (P<0.05 orP<0.01). Naringenin evidently increased Na+/K+-ATPase activities to 6.82, 6.83 and 6.94 mmol Pi/(g·h), respectively, compared to 5.54 mmol Pi/(g·h) of model group (P<0.05). Naringenin (100 and 50 mg/kg) significantly increased Ca2+/Mg2+-ATPase activities to 8.42 and 8.97 mmol Pi/(g·h), respectively, compared to 7.06 mmol Pi/(g·h) of model group (P<0.05).Conclusions The protective effects of naringenin pretreatment in myocardial ischemia/reperfusion injury seems to be associated with the improvement of energy metabolism.

naringenin; myocardial ischemia/reperfusion injury; rat; energy metabolism

国家自然科学基金(81102870)

骞秀芳，本科学历，主管药师。

1.100027，武警北京总队第二医院药剂科；2.450046 郑州，河南中医药大学药学院

张国斌，E-mail: zgb@hactcm.edu.cn

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