基于肺脏特性中药干预哮喘缓解期家兔的尿液代谢组学研究

2017-07-19陈馨馨李友林

中国老年保健医学 2017年3期

陈馨馨李友林

·论著·

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目的哮喘(中医哮病)缓解期的治疗为该病向愈或发作加重的拐点。本实验在成功建立哮喘缓解期动物模型的基础上通过中药干预检测尿液代谢产物的变化，找出与哮喘发生机理以及中药干预密切相关的代谢产物。方法将实验动物随机分为对照组、模型组和中药组，每组给予相应干预后取尿液进行代谢组学检测，找出共有代谢产物，通过统计学分析确定有意义代谢产物。结果检测共有代谢产物31种，发现有意义代谢产物4种。结论这4种代谢产物与支气管哮喘的发生机理及中药疗效密切相关，为临床诊断过敏性支气管哮喘及判断中药疗效提供参考。

代谢组学支气管哮喘尿液代谢产物中药干预

支气管哮喘是一种常见且比较顽固难治的肺系疾患，甚至可以伴随终身。我国目前已成为全球哮喘病死率最高的国家之一，如何提高支气管哮喘的诊断率，其临床意义重大。本课题组已成功建立支气管哮喘缓解期模型家兔[1]，利用代谢组学的研究方法，鉴别出模型家兔血清[2]及支气管肺泡灌洗液[3]中多项有意义代谢产物，我们现利用同样代谢组学方法、方药及统计学方法观察尿液代谢产物的变化，从而为临床诊断该病提供参考。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：选取纯白色新西兰家兔21只，由北京海淀兴旺实验动物养殖厂提供。随机分为对照组、模型组和中药组，每组7只。

1.1.2 造模药物及仪器：① 卵蛋白干粉(ovalbumin,OVA)Ⅲ级，购自美国sigma公司；② 402A型超声雾化器，由江苏鱼跃医疗设备有限公司出品；③ olympus显微镜；④ cytosprinⅡ细胞离心机(英国珊顿公司)；⑤ 北京普利生医学仪器公司图像自动分析系统。

1.2 方法

1.2.1 模型制备[1]：模型组和中药组予10%卵蛋白溶液腹腔注射，对照组予等剂量生理盐水腹腔注射。具体方法详见参考文献[1]。

1.2.2 法则制定及中药干预：追述传统医学史，由于宿痰伏肺，导致气道挛急，而致发作性痰鸣气喘的疾患历代医家早有多种命名。《素问·阴阳别论》有“喘鸣”之说；《金匮要略》则称为“上气”；直至元代朱丹溪才首创“哮喘”病名，把本病从笼统的“喘鸣”“上气”中分离出来，后世医家为与喘证区分，故名为“哮病”。

支气管哮喘(中医哮病)的分证论治分为发作期和缓解期。发时治标，缓时治本。缓解期是指无急性发作，在相当长的一段时间内具有不同程度和频度的“咳嗽、气急、喘息和胸闷”等一系列症状。缓解期病机特征为虚实夹杂，正虚为主。该期分为肺虚、脾虚、肾虚三种证型。肺气虚则气短喘息，卫外功能失司，外邪易侵而发为哮病。脾为肺“母”，子病盗母气，脾虚水湿不运，母病及子，肺脾两虚，则气短喘促。肾为肺“子”，母病及子，肾虚摄纳失常，气不归元，精气亏乏，不能充养，因劳累等导致哮病发作。

中医药治疗支气管哮喘缓解期的患者是从“固本培元”的角度加强人体自身正气，所谓“正气存内，邪不可干”，通过“固本”令肺脾肾三脏功能健运，以减少、缓解支气管哮喘的发作。肺脾肾三脏之中肺为“华盖之脏”，遇邪首当其冲，故治疗该病的关键就在于缓解期对肺脏的干预。西药治疗存在激素依赖、副作用较大等问题，而减少副作用、减少并发症成为中医药治疗的优势[4]。

肺脏生理特性为：以温通和降为顺，喜温润恶燥寒。生理功能为主气、司呼吸，《素问·五脏生成篇》说:“诸气者，皆属于肺”。陈修园《医学实在易》说：“气通于肺脏，凡脏腑经络之气，皆肺气之所宣”。就气与五脏的关系而言，气关于脾，出于肺，根于肾。病理特性：肺为华盖之脏，肺叶娇嫩，不耐寒热，容易被寒邪、燥邪等邪气侵犯。

肺脏用药性味特点:①《金匮要略·痰饮咳嗽篇》曰：“病痰饮者当以温药和之”。痰饮得寒则聚，得温则行，温药可以发越阳气，温化寒痰。故药性宜温润，但“温”又不可太过,太过则易化燥，当以“和”为原则，故燥者应佐之以“润”。②《素问·阴阳应象大论》曰:“辛生肺”。辛味药入肺经,其清扬发散之性可宣达肺部,助肺发挥宣发肃降之功，还可通过皮毛驱散表邪。雷丰[5]《时病论》曰：“肺属辛金，金性刚燥，所以恶寒冷而喜温润也”宜施“温润辛金法”。

就五行对五脏的角度而论，肺脏属金。从相生关系而论，脾脏属土，为其母脏；肾脏属水，为其子脏。从相克关系而论，心脏属火，火克金，心克肺；肝脏属木，金克木，肺克肝。综上所述，治疗肺疾当考虑五行关系及相生相克之法:虚证用补法，补其母脏(脾脏)，利用“培土生金”之法治疗肺脾气虚者。再者补其子脏(肾脏)，利用“金水相生”之法治疗肺肾阴虚者。实证用泻法，从相克关系考虑，利用“木火刑金”之法治疗肝火犯肺之证。

综合肺脏的生理特点、病理特性、用药性味特点以及与五行相关的内容可知肺病多喘，肺脏用药宜“温、润、辛”。制定“温润辛金培本平喘”为基本法则。在该法则指导下拟中药复方为基本方药：五味子9g，酸、甘，温，归肺、心、肾经；味酸收敛，甘温而润，能上敛肺气，下滋肾阴，为治疗久咳虚喘之要药；量取9克，补益肺肾，敛肺气而止喘咳，针对肺肾不足之喘咳用为君药。淫羊藿4.5g，辛、甘，温；归肾、肝经；补肾壮阳，止咳平喘；量取4.5g，辅五味子补益肺肾用为臣药。防风6g，辛、甘，微温；归膀胱、肝、脾经；气味俱升，甘缓微温不峻烈，质松而润，祛风之力较强，为“风药之润剂”“治风之通用药”，功善祛风止痉；量取6g，与五味子协同，固本而不留邪，共奏扶正祛邪之效用为佐使药。蜜炙旋覆花(包煎)4.5g，苦、辛、咸，微温；归肺、胃经；苦降辛开，降气化痰平喘咳，蜜炙增加润肺之效；量取4.5g包煎，功主降肺气，与五味子、淫羊藿补益肺肾相伍亦为佐使药。将上述方药采取水煎法提取，95%乙醇浓缩，60℃干燥后制成细粉，每只实验家兔每天灌胃药粉量为0.35g，治疗3天后化验对照组、中药组与模型组动物的尿液代谢产物。

1.2.3 尿液标本采取：尿液是机体在新陈代谢过程中所产生的终产物，机体发生病变时，尿液中可出现一些异常成分。现将选取造模成功的支气管哮喘缓解期实验家兔的尿液代谢产物进行检测分析，找寻出与有意义的代谢产物。把实验家兔固定于解剖台上，呈仰卧位，用碘伏将尿道口消毒后左手固定住家兔尿道口，右手持尖端涂有消毒凡士林或液体石蜡的导尿管缓慢地轻轻插入尿道，进入约7～13cm。如果导尿管进入膀胱腔，即有尿液流出，然后再用胶布将导尿管与家兔固定，用标准离心管接取尿液2ml，用离心机在室温、9000rpm的条件下，离心15分钟，采用气相色谱——质谱联用(GC—MS)分析上清液。

1.2.4 检测步骤：首先将40μL家兔尿样加入10μL尿素酶，在37℃下培养10分钟后，加入100μL甲醇混匀，然后再加入15μL核糖醇在70℃下100rmp离心摇匀15分钟后，再130000rmp离心10分钟取上清，吹干，加入40μL盐酸甲氧胺(20mg/ml吡啶)、40μLMSTFA(含1%TMCS)，取上清液进样，分析仪得出图谱。