酵母浸出物对屎肠球菌活菌数的影响

吴瑞方，胡成远，孙付保，彭明，孙海彦，*

（1.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口571101；2.湖北海宜生物科技有限公司，湖北襄阳441409；3.江南大学生物工程学院，江苏无锡214122）

酵母浸出物对屎肠球菌活菌数的影响

吴瑞方1，胡成远2，孙付保3，彭明1，孙海彦1，*

（1.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口571101；2.湖北海宜生物科技有限公司，湖北襄阳441409；3.江南大学生物工程学院，江苏无锡214122）

屎肠球菌（Enterococcus faecium）发酵饲料中的活菌数是保证其功能特性的关键因素，为了提高屎肠球菌发酵过程中的活菌总数，本研究以屎肠球菌为试验菌株，选用4种不同特性的酵母浸出物来考察其对屎肠球菌活菌数的影响。通过单因素试验，确定以酵母浸出物为唯一氮源培养屎肠球菌的活菌数，根据酵母浸出物检测指标找出影响屎肠球菌活菌的关键因子。试验结果表明，培养基中主要提供生长因子和微量元素的酵母浸出物对屎肠球菌的活性有明显的影响，其中游离核苷酸的含量是影响屎肠球菌发酵活菌数重要因子，通过外源添加一定量的游离核苷酸，厌氧培养12 h，获得的最终活菌数为176×108CFU/mL，与未添加游离核苷酸相比，活菌数提高了将近40%。结果显示，在培养基中添加一定量的游离核苷酸可提高屎肠球菌在发酵液中活菌数量，为工业化生产高活菌数的饲用屎肠球菌提供参考和借鉴。

屎肠球菌；活菌数；酵母浸出物；游离核苷酸；氨基态氮

屎肠球菌（Enterococcus faecium）属于革兰氏阳性球菌，是乳酸菌类益生菌的一种，为肠球菌属，菌落形态程圆形或椭圆形，具有调节单胃动物肠道微生物菌群，抑制肠道致病菌的功效[1]。屎肠球菌抗逆性较强，对部分抗生素也具有较好的耐药性，被广泛地应用于动物微生态制剂和食品添加剂等领域，与其他益生菌配伍，可用于调节动物肠道菌群，提高动物免疫力、改善生长性能[2-3]。

研究表明[4-5]，屎肠球菌在动物肠道内的存活和增殖对其功效的发挥起到决定性作用，要获得理想的饲养效果，其活菌量必需达到足够多的数量。然而，益生菌最大的缺点是活菌期时间短[6]。在屎肠球菌发酵培养过程中保证其存活是当前急需解决的关键技术之一[7-8]，因而，屎肠球菌作为饲用益生菌类微生态制剂进行产业化开发时，需要采用有利于菌体活性稳定的生产工艺，使活菌量在发酵培养结束后尽可能维持较高的水平。

近年来，屎肠球菌的研究主要集中在饲用效果、作用机理、菌株筛选及发酵工艺等方面[9-11]，通过优化培养基生长因子来提高其活菌数的研究较少[12]。在益生菌发酵培养基中，酵母浸出物是非常重要的氮源之一，其主要为益生菌的生长提供生长因子和微量元素，而这类营养物是影响益生菌生长和活性的关键生长因素[13]。因此，本试验通过以不同酵母浸粉为唯一氮源发酵培养屎肠球菌，对比分析不同培养条件下的活菌数，并找出其中的关键影响因子，为工业化生产高活菌数屎肠球菌的进一步研究提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种、试剂与培养基

屎肠球菌（Enterococcus faecium）由中国热带农业科学院热带生物技术研究所微生物资源利用研究组保存。

NaCl、MgSO4·7H2O、CaCO3为国产分析纯试剂；MRS（de Man，Rogosa and Sharpe）合成培养基：广东环凯微生物科技有限公司；蔗糖、酵母浸粉、琼脂粉、游离核苷酸（含 AMP、CMP、GMP、UMP、IMP）均为国产生化试剂；酵母浸粉FM803：安琪酵母股份有限公司；高核苷酸酵母浸粉FG0342、普通酵母浸粉FY0127：湖北海宜生物科技有限公司；酵母浸粉Kerry 412：Kerry公司，其理化指标见表1。

表1 不同酵母浸粉的理化指标Table 1 The physical and chemical indexes of yeast extract powder

斜面、平皿和计数平皿培养基均为MRS固体培养基；摇瓶种子培养基：MRS液体培养基；摇瓶发酵培养基：蔗糖 20.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，CaCO32.2 g/L，酵母浸粉10 g/L，蒸馏水1 L。

1.2 仪器设备

pH计（梅特勒FE20K Five Easy Plus pH计）：梅特勒-托利多；SPX-350智能生化培养箱：宁波赛福实验仪器有限公司；721型可见分光光度计：天津市普瑞斯仪器有限公司；高压灭菌锅：日本Hirayama HVE；SWCJ-1FD单人单面垂直净化工作台：上海博迅。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化及扩培

取-80℃保存的屎肠球菌冻存管1支，在MRS平板上划线，37℃培养20 h～24 h，挑取单菌落活化至新鲜斜面上，37℃培养18 h～20 h，用接种环从活化斜面上刮取一环菌体接种于100 mL液体MRS培养基中，37℃静置过夜培养。

1.3.2 屎肠球菌发酵培养基单因素试验

以酵母浸粉为试验因子，改变摇瓶发酵培养中的唯一氮源成分，配制含不同型号酵母浸粉的发酵培养基，121℃灭菌15min。发酵温度为37℃，接种量为1%的条件下静置培养12 h，得到屎肠球菌发酵液。

1.4 主要指标的测定

1.4.1 酸度的测定

pH值测定用梅特勒FE20K Five Easy Plus pH计直接测定。

1.4.2 OD值的测定

屎肠球菌在特定波长条件下吸光值与活菌量之间呈现相关性，因此可用测定的发酵液的OD600值来反应屎肠球菌在摇瓶中的生长情况[14]。为了消除发酵液中CaCO3对吸光值的干扰，选取1%的HCl溶液作为发酵液的稀释液，使待测溶液变澄清，测定吸光度。

1.4.3 活菌数测定

活菌总数：参照GB 4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》[15]，梯度稀释涂布平板后，37℃培养24 h，计菌落数，以菌落平均数计为该样品的单位活菌数。

2 结果与分析

2.1 屎肠球菌在以不同酵母浸粉为唯一氮源的培养基中生长过程OD和pH值的变化情况

屎肠球菌在以不同酵母浸粉为唯一氮源的培养基中生长过程OD和pH值的变化情况见图1。

图1 屎肠球菌在不同氮源条件下培养过程中的OD值和pH值变化Fig.1 The time courses of OD value and pH value by E.faecium with the different nitrogen sources in the initial fermentation media.

从图1（a）可看出，屎肠球菌从一开始菌数急增，经过短暂的延滞期后进入对数生长期，其在8 h后生长速度开始减缓，进入稳定期，然而其OD值并未表现出下降，这表明一部分菌已经开始被自身所产生的代谢产物抑制或者杀死。经培养12 h后，各个摇瓶中的OD600吸光值表现出了差距，其中以高核苷酸酵母浸出物FG0342与Kreey 412为氮源的屎肠球菌表现的最为突出，OD值分别为3.62和3.51。

pH值反映游离氢离子的浓度，其中乳酸是屎肠球菌的主要代谢产物，也是酸度升高的重要因素。由图1（b）可知，4组不同培养条件下的屎肠球菌在pH值变化程度上基本保持一致，最终达到的pH值也相当，无明显差别。但是Kerry 412在2 h～8 h之间产酸表现得最为突出，这说明在该氮源条件下不仅有利于屎肠球菌的产酸也是其细胞代谢最旺盛的时间段，这可能与其营养物质的组成有关，而以高核苷酸型FG0342为唯一氮源的屎肠球菌的产酸则表现得相对缓和，尽管其生物量最终超过了以Kerry 412为氮源的屎肠球菌，这从侧面说明酵母浸出物不仅对菌体自身生长产生影响，也会通过控制菌体的生长速率来改变其胞内代谢途径。

2.2 不同酵母浸出物对屎肠球菌活菌数的影响

通过使用4种不同特征的酵母浸粉来培养屎肠球菌，按照发酵培养条件，平板计数，具体结果见表2。

表2 不同氮源对屎肠球菌活菌数的影响Table 2 Effect of different nitrogen sources on viable count of E.faecium

从表2可知，Kerry 412、FG0342两种氮源的屎肠球菌活菌总数均比较高，随着时间的推移，4种氮源培养的屎肠球菌活菌总数都在增加，其中4 h至8 h之间增长得最为显著，这与发酵液OD值变化趋势表现是一致的，从而说明OD值的变化能在一定程度上反应出发酵液中的活菌总数的变化，但是在12 h时，从OD值过程曲线来看（图1），Kerry 412、FG0342两种氮源的屎肠球菌OD值是相近的，而实际的活菌数则分别是 164×108CFU/mL 和 192×108CFU/mL，这一结果可能是由于以Kerry 412为氮源的屎肠球菌在培养过程中有一部分细胞死亡而干扰了OD值的读数。

2.3 游离核苷酸添加对屎肠球菌发酵活菌数的影响

在FY0127和FM803两种酵母浸粉中按照一定的比例加入游离核苷酸混合样，充分混匀后，按照既定的摇瓶发酵培养基进行屎肠球菌摇瓶发酵，发酵周期为12 h，梯度稀释平板计数，结果见表3。

表3 游离核苷酸对屎肠球菌活菌数的影响Table 3 Effect of free nucleotides on viable count of E.faecium

试验结果表明：添加一定比例的游离核苷酸，活菌数量都有所提高，几乎达到了以Kerry 412为氮源时的相当水平（见表2）。核苷酸的添加有利于屎肠球菌在培养过程中保持较高的细胞活性，加速细胞的分裂。在一定范围内，活菌数量随着培养基中核苷酸量的增加而呈现正相关趋势，之后，核苷酸含量的增加细胞活菌数不再增加，这表明过量的游离核苷酸不会促进细胞分裂和活性维持。

3 讨论

在培养基成分中，氮源是影响乳酸菌生长活性的主要因素，酵母浸出物能为细胞生命活动提供大量氨基酸、维生素、矿物质和微量元素，能促进微生物对营养物质的吸收，有利于维持微生物的生长活力，缩短细胞分裂时间，是培养基中不可或缺的生长因子提供物[13]。屎肠球菌作为农业部批准使用的有益微生物菌种之一，被广泛应用于养殖业中，为减少和避免使用抗生素做出了很大的努力和贡献，但是现有工艺生产的屎肠球菌其质量要求表现为有效活菌数不足，直接影响其使用效果和推广应用。

本试验通过选取4种不同型号、不同特性的酵母粉，为屎肠球菌发酵培养基中的唯一氮源，以期通过提高屎肠球菌扩培过程中单位体积活菌数，为下游微生态制剂提供较好的质量保障，也为进一步开发益生菌微生态制剂提供可借鉴的理论依据。

结合酵母浸粉理化指标（表1）和试验结果可得知，游离核苷酸对屎肠球菌在发酵过程维持较高的活力具有明显的促进作用，这可能是因为屎肠球菌自身缺乏对许多有机化合物的合成能力，其生长代谢偏向于核苷酸补救途径，在发酵培养过程中从外界摄取游离核苷酸用于合成自身生长分裂所需的核酸类物质，这一现象通过随后的额外添加游离核苷酸试验（表3）得以验证，在添加一定量的游离核苷酸后，以FM803为氮源的屎肠球菌活菌数从原先的107×108CFU/mL上升到最高176×108CFU/mL，且以FY0127为氮源的屎肠球菌活菌数从75×108CFU/mL迅速上升到最高126×108CFU/mL。培养基中游离核苷酸的存在，可通过细胞吸收后直接用于DNA合成，无需再从头合成细胞分裂增殖所需的物质，有利于促进细胞分裂，同时还能通过回补途径代谢成其它所需营养物质，维持细胞的生命活动，使其不至于过早衰亡，但是过量的游离核苷酸却无助于提高屎肠球菌的活细胞数量，另而会增加培养基成本，间接提高生产成本，因此，当培养基中游离核苷酸量满足细胞生长需求，则无需额外添加混合游离核苷酸，通过试验可以看出，初始培养基中游离核苷酸含量为0.01%～0.02%较宜。

此外，结合表1，从图1可以看出，氨基态氮对细胞生长也有较大的影响，酵母浸出物中含有丰富的蛋白质、氨基酸、多肽，其中游离氨基酸、小肽（分子量约在180～1 000之间）对乳酸菌的生长和维持较高生产速率有一定的帮助，能够提高乳酸菌的最大比生长速率[13]。但是过高的氨基肽氮却不利于维持细胞活性，4种酵母浸粉中FM803氨基氮高达6.27%，在发酵初期其生长速率明显快于其它3组试验，但在第6 h时开始放缓，显得后劲不足，这可能是前期过快地生长消耗掉培养基中大量的营养物，细胞死亡自溶有关，使得其提前进入稳定期，最终的活菌数为107×108CFU/mL（表2）也说明了这一事实。然而，培养基中氨基氮过低却也不利于屎肠球菌的生长，其中以FY0127为氮源的屎肠球菌生长速率在整个过程中保持较低，这与乳酸菌自身酶系不发达，尤其是蛋白酶活性较弱甚至缺乏必要的蛋白酶有关[16]，对分子量较大的多肽利用效率不如小分子小肽和游离氨基酸，尽管在外源游离核苷酸添加后其活菌数得到了一定的改善，但是其最高也只达到了126×108CFU/mL，具体结果见表3，与对照组相比，活菌数一直处于较低数量。因此在培养屎肠球菌过程中如何控制屎肠球菌保持一定的生长速率，使其不至于过早衰亡也是是我们在平时生产过程中应该考虑的问题之一。

4 结论

本试验选定4种不同理化指标的酵母浸出物来发酵生产高密度活菌的屎肠球菌，通过分析酵母浸粉产品指标，结合试验现象得到以下结论：

1）培养基中的游离核苷酸有利于提高和维持屎肠球菌细胞活性，但是过量的游离核苷酸对进一步提高活菌数没有明显的帮助，出于生产成本考虑，初始培养基中游离核苷酸含量为0.01%～0.02%较宜。

2）在培养屎肠球菌过程中，氨基态氮对屎肠球菌的生物量具有决定性作用，作为培养基中的速效氮源，能快速被细胞吸收直接用于自身生命活动，但是初始培养基中过高的氨基态氮会使细胞不加控制地快速生长，消耗培养基中大量营养物，提早衰亡，不利于细胞活性的维持。

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Influence of Yeast Extract on Viable Count of Enterococcus faecium

WU Rui-fang1，HU Cheng-yuan2，SUN Fu-bao3，PENG Ming1，SUN Hai-yan1，*
（1.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101，Hainan，China；2.Hubei HIYEE Biotechnology Co.，Ltd.，Xiangyang 441409，Hubei，China；3.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

The viable count of Enterococcus faecium was the key factor to functionality of fermented feed.To get the highest viable count of E.faecium during the fermentation period，the effects of the four different characteristics of yeast extracts on that was discussed.With the method of single factor experiment，the viable count of E.faecium was determined by shake-flask cultures using yeast extract as a sole nitrogen source.Then based on the detecting results of yeast extract，the crucial factors of effect on the viable count could be finding out.Experiments have indicated that yeast extract which provides growth factors and microelement has significant impact on the cellular activity of E.faecium，and the initial concentration of free nucleotides in the media was the important factor that affects the vitality of E.faecium.By adding a certain amount of free nucleotides，and incubating under anaerobic conditions for 12 hours，the maximum number of viable count wasattained 176×108CFU/mL，which was nearly 40%higher than the maximum number of viable count before the optimization process.The conclusion was that the viable count of E.faecium could be improved by added a certain amount of free nucleotides in the initial media，and it was applied to the industrialized production of probiotic strains used in fermented feed production.

Enterococcusfaecium；viable count；yeast extract；free nucleotides；amino nitrogen

2017-02-06

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.037

中国热带农业科学院基本科研业务费基金（1630052016007、1630052016012、1630052016021）

吴瑞方（1986—），男（汉），研究实习员，硕士，研究方向：发酵工程。

*通信作者：孙海彦，副研究员。