小根蒜挥发油抑菌活性的研究

岳玉秀

（吉林工程职业学院，吉林四平136001）

小根蒜挥发油抑菌活性的研究

岳玉秀

（吉林工程职业学院，吉林四平136001）

在研究小根蒜挥发油的抑菌活性试验中，选择了青霉、酿酒酵母、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌4种常见的霉菌、真菌、细菌为受试菌种，采用了滤纸片法进行抑菌活性分析。结果表明，小根蒜挥发油对这4种菌种都有明显的抑制作用，根据抑菌圈直径大小可以判断其对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果相对较强；而对于青霉菌和酿酒酵母菌抑制效果一般。用分光光度计对不同浓度的抑菌液培养的液体培养基进行比色测定，测定OD值，OD值越低抑菌性越好。结果显示，小根蒜挥发油抑菌液对酿酒酵母最低抑菌浓度为1.25%，对青霉最低抑菌浓度为0.63%，对大肠杆菌最低抑菌浓度为0.63%，对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度为0.31%。

小根蒜挥发油；菌种；抑菌活性

小根蒜作为一种药食同源的山野菜，含有多种生物活性成分[1]，具有通阳开痹、温中理气、健胃整肠，抗菌消炎等多种珍贵的保健食疗价值[2]。小根蒜中提取油可在养生与医疗保健中获得较大应用[3-5]。本试验选择资源丰富的野生药用植物小根蒜为材料，对抑菌物质进行有效提取，实现了小根蒜的深度开发利用，丰富了其经济价值，同时确定了小根蒜提取油的抑菌活性，为开发纯天然、无污染的植物源防腐剂提供依据[6-7]。对提取出来的小根蒜挥发油的抑菌活性进行确定，并且确定了小根蒜挥发油对青霉、酿酒酵母、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

小根蒜挥发油：吉林工程职业学院生物工程分院实验室提取；丙三醇（分析纯）：杭州邦易化工有限公司；牛肉膏（分析纯）、蛋白胨（分析纯）、琼脂粉（分析纯）：天津市化学试剂二厂；葡萄糖（分析纯）：济宁百川化工有限公司；氯化钠（分析纯）：北京奥博星生物技术有限责任公司；硝酸钠（分析纯）：新乡市中信化工有限公司；磷酸氢二钾（分析纯）、硫酸镁（分析纯）、氯化钾（分析纯）、硫酸亚铁（分析纯）：北京化工厂；蔗糖（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 供试菌种

本试验选用常用菌种：青霉、酿酒酵母、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌（菌种均由吉林工程职业学院生物工程分院实验室保存）。

1.3 培养基

细菌用牛肉膏一蛋白胨培养基；酵母菌用PDA培养基；霉菌用察氏培养基。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠 5 g、琼脂 20 g、蒸馏水 1 000 mL，加热溶解，用酸度计调节pH为7.2～7.4。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯（去皮切块）300 g、葡萄糖 20 g、琼脂 20 g、蒸馏水 1 000 mL。将马铃薯去皮切块，加1 000 mL蒸馏水，煮沸25 min。用纱布过滤，补加蒸馏水至1 000 mL。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装，121℃高压灭菌20 min。

查氏培养基：硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、硫酸镁0.5 g、氯化钾 0.5 g、硫酸亚铁 0.01 g、蔗糖 30 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，加热溶解，分装后在121℃条件下灭菌20 min。

1.4 设备与仪器

SPX-250B-Z型生化培养箱、SPX-250B-D型振荡培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；LSC-239CW型立式冷藏陈列柜：星星集团有限公司提供；UV2300型紫外可见分光光度计：上海天美科学仪器有限公司提供；O1J2003-04型立式压力蒸汽灭菌筒：上海东亚压力容器制造有限公司提供；KYC-100C型空气恒温摇床：上海新苗医疗器械制造有限公司提供；DW-FL90型数字酸度计：上海鹏顺科学仪器有限公司提供；FA2004型电子天平：上海上平仪器公司提供；DM-1000型光学显微镜：Leica Microsystems产品；MC-PYl 8A型多功能电磁炉：广东美的生活电器制造有限公司提供。

1.5 方法

1.5.1 原料预处理

配制20%的丙三醇水溶液，再用其配制0.05 g/mL的小根蒜挥发油试样。

1.5.2 菌种的活化

取出冷藏状态不同的菌种，在无菌环境中各接种150 μL到已灭菌的5 mL液体培养基中，根据不同菌种的最佳培养温度设置震荡培养箱的温度，将接种后的液体培养基放入对应的培养箱中，震荡培养24 h，如此反复，直至得到第三代菌悬液。

1.5.3 抑菌效果测定

采用滤纸片扩散法测定小根蒜挥发油抑菌效果。用滤纸（定性）制作成直径为6 mm的圆形纸片，放入无菌室中紫外照射30 min，再将其分两份，分别浸泡于含5%小根蒜挥发油溶液和20%丙三醇溶液中放置到无菌室备用。把平板放入烘箱160℃，进行灭菌4 h，取出放到无菌室中备用，待冷却后将固体培养基快速倒进平板里等待液体自动凝固，在无菌室中，采用涂布平板法，将配制好的菌悬液震荡摇匀，用无菌移液枪吸取150 μL菌悬液，将其均匀地涂布于平板固体培养基中，再将滤纸片放置在含菌平板上，每个纸片相隔一定间距，每种菌设3个重复，并设空白对照（一个平板放3张浸有小根蒜挥发油溶液的滤纸片再放入和1张浸有20%丙三醇溶液的滤纸片）然后将其倒置于培养箱中恒温培养，真菌28℃，48h，细菌37℃，24h。时间到达测量抑菌圈的直径，取平均值。

1.5.4 最低抑菌浓度的测定

用分光光度计对不同浓度的抑菌液培养的液体培养基进行比色测定，测定OD（吸光值）值，OD越低抑菌性越好，从不同浓度小根蒜挥发油液培养的培养基的OD值变化，可以判断出最低抑菌浓度。具体操作：配制出25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.562 5%一系列浓度的小根蒜挥发油抑菌液，在无菌环境下，称取9mL已灭菌的液体细菌培养基，分装试管。用无菌移液枪取不同浓度的小根蒜挥发油抑菌液1 mL，加入到液体培养基的试管中，摇匀，此时液体培养基中，小根蒜挥发油抑菌液的浓度都降低10倍。每一系列接种1种菌，接种量为3%，每个浓度设3个重复。对照系列不接菌，适宜温度下，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌培养24 h，每4小时进行OD（吸光值）值测定，酿酒酵母、青霉培养48 h，每8小时进行OD值测定，波长580 nm。

2 结果与分析

2.1 小根蒜挥发油抑菌效果的影响

小根蒜挥发油对几种菌落的抑制作用结果如表1所示。

表1 小根蒜挥发油（AMB）对菌种的抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of AMB volatile oil on strains

从表中可以反映出，小根蒜护发油对酿酒酵母菌、大肠杆菌、青霉、金黄色葡萄球菌菌种都有抑制的作用。根据抑菌圈直径大小初步可以判断其对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果相对较强；而对于青霉菌和酿酒酵母菌抑制效果一般。

2.2 小根蒜挥发油最低抑菌浓度的测定

不同浓度小根蒜挥发油抑菌液对酿酒酵母的抑菌效果见图1。

图1 不同浓度小根蒜挥发油抑菌液对酿酒酵母的抑菌效果Fig.1 Antibacteria effect of different concentrations AMB votatile oil antibacterial liquid on Saccharomyces cerevisiae

由图1可知，从对照组的OD值曲线，可以看出小根蒜挥发油抑菌液所有浓度受试对酿酒酵母都有一定的抑菌作用。而在浓度≤1.25%时，OD值随时间变化明显升高，表明在此浓度以下，小根蒜挥发油抑菌液抑菌效果不显著。当浓度大于此浓度时，吸光值上升缓慢，表明在一定程度上有效的抑制酿酒酵母生长繁殖。确定小根蒜挥发油抑菌液对酿酒酵母最低抑菌浓度为1.25%。

不同浓度小根蒜挥发油抑菌液对青霉的抑菌效果见图2。

图2 不同浓度小根蒜挥发油抑菌液对青霉的抑菌效果Fig.2 Antibacteria effect of different concentrations AMB votatile oil antibacterial liquid on Penicillium

由图2可知，小根蒜挥发油抑菌液浓度≤0.63%时，OD值变化十分明显升高，几乎与对照组相似，这说明青霉生长繁殖没有被有效的抑制。而当浓度超过此浓度时，吸光值则上升非常缓慢，表明在一定程度上有效的抑制青霉生长繁殖。确定小根蒜挥发油抑菌液对青霉最低抑菌浓度为0.63%。

不同浓度小根蒜挥发油抑菌液对大肠杆菌的抑菌效果见图3。

图3 不同浓度小根蒜挥发油抑菌液对大肠杆菌的抑菌效果Fig.3 Antibacteria effect of different concentrations AMB votatile oil antibacterial liquid on Escherichia Coli

由图3可知，在小根蒜挥发油抑菌液浓度≤0.63%时，大肠杆菌液体培养基的OD值明显升高，表明在此浓度以下，小根蒜挥发油抑菌液抑菌效果不显著。当浓度大于此浓度时，吸光值上升缓慢，表明在一定程度上有效的抑制大肠杆菌生长繁殖。确定小根蒜挥发油抑菌液对大肠杆菌最低抑菌浓度为0.63%。

不同浓度小根蒜挥发油抑菌液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果见图4。

图4 不同浓度小根蒜挥发油抑菌液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果Fig.4 Antibacteria effect of different concentrations AMB votatile oil antibacterial liquid on Staphylococcus aureus

由图4可知，在小根蒜挥发油抑菌液浓度≤0.31%时，金黄色葡萄球菌液体培养基的OD值明显升高，表明在此浓度以下，小根蒜挥发油抑菌液抑菌效果不显著。当浓度大于此浓度时，吸光值上升缓慢，表明在一定程度上有效的抑制金黄色葡萄球菌生长繁殖。确定小根蒜挥发油抑菌液对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度为0.31%。

3 结论与讨论

在研究小根蒜挥发油的抑菌活性试验中，采用了滤纸片分析法根据抑菌直径长短的指标来判断抑菌活性。结果表明，小根蒜挥发油菌种青霉、酿酒酵母、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌都有明显的抑制作用，但抑制效果大小不同，根据抑菌圈直径大小可以判断其对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果相对较强；而对于青霉菌和酿酒酵母菌抑制效果一般。用分光光度计对不同浓度的抑菌液培养的液体培养基进行比色测定，测定OD值，OD值越低抑菌性越好，从不同浓度小根蒜挥发油液培养的培养基的OD值变化，可以判断出最低抑菌浓度。结果显示，小根蒜挥发油抑菌液对酿酒酵母最低抑菌浓度为1.25%。小根蒜挥发油抑菌液对青霉最低抑菌浓度为0.63%。小根蒜挥发油抑菌液对大肠杆菌最低抑菌浓度为0.63%，小根蒜挥发油抑菌液对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度为0.31%。

从抑菌活性试验得出的结论上可以看出，小根蒜挥发油有一定的抑菌效果，这一结论与其他参考文献即研究实验结果相符，但本试验只针对青霉、酿酒酵母、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌4种菌种进行试验，暂时不能笼统概括小根蒜挥发油对其他霉菌、真菌、细菌具有抑菌活性。

[1]姚玉霞.苣荬菜、小根蒜营养成分分析[J].营养学报,2003,25(2)：173-174

[2]姜晓莉,工淑玲.小根蒜的营养价值与开发利用[J].特种经济动植物,2000(6)：22

[3]吴朝霞,夏天爽,李琦,等.同时蒸馏法提取艾叶挥发油及其抑菌性研究[J].食品研究与开发,2010,31(8)：19-22

[4]王雅,赵萍,任海伟,等.微波辅助萃取葫芦巴茎叶挥发油工艺优化及抗氧化性研究[J].食品科学,2011,32(16)：326-329

[5]Mimaki Yoshihiro,Kawashima Kazuhiro,Kanmoto Toshihiro,et al.Steroidal glycosides from Allium albopilosum and A.ostrowskianum[J].Phytochemistry,1993,34(3)：799

[6]张志军,刘西亮,李会珍,等.植物挥发油提取方法及应用研究进展[J].中国粮油学报,2011,26(4)：118-122

[7]张香美,刘焕云,王春霞,.小根蒜抑菌作用的初步研究[J].安徽农业科学,2005,33(9)：1676-1677

Study on Bacteriostasis Activity of the Allium macrostemon Bunge Volatile Oil

YUE Yu-xiu
（Jilin Engineering Vocational College，Siping 136001，Jilin，China）

In the research of Allium macrostemon Bunge volatile oil antibacterial activity test，Penicillium and Saccharomyces cerevisiae，Escherichia coli，Staphylococcus aureus were selected，four kinds of common mold，fungi，bacteria as test strain，and the filter paper method was used to analysis of antibacterial activity.Results showed that Allium macrostemon Bunge volatile oil had obvious inhibitory effect on the four kinds of strain.According to the diameter size of the inhibition zone，it could be judged that the inhibitory effect on Escherichia coli and Staphylococcus aureus were relatively stronger；while on the effect Penicillium and Saccharomyces cerevisiae were modest.Taking colorimetric determination to different concentrations of antibacterial liquid culture medium with spectrophotometer determined the OD value，the lower value，the better antibacterial activity.The results showed that the minimum inhibitory concentration of Allium macrostemon Bunge volatile oil antibacterial liquid on Saccharomyces cerevisiae was 1.25%，on Penicillium was 0.63%，on Escherichia coli was 0.63%and on Staphylococcus aureus was 0.31%.

Allium macrostemon Bunge volatile oil；strain；antibacterial activity

2016-10-04

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.005

岳玉秀（1984—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：食品加工与安全。