海南畜禽粪中四环素类和大环内酯类抗生素的含量及其分布特征

姚 倩，高玲琳，姜亚磊，杨雨辉，王学梅

海南畜禽粪中四环素类和大环内酯类抗生素的含量及其分布特征

姚 倩，高玲琳，姜亚磊，杨雨辉，王学梅

(海南大学 热带农林学院，海南 海口 570228)

利用超声波提取-固相萃取高效液相色谱法测定了海南省不同地区典型养殖场鸡/猪粪便中2种四环素类(TCs)和2种大环内酯类(MLs)抗生素的含量与分布特征.结果表明：四环素类化合物的平均总含量和检出率均高于大环内酯类化合物的平均总含量和检出率.在猪粪中，四环素类化合物的总含量在0～8 460.8 μg·kg-1之间，平均为385.4 μg·kg-1，检出率最低为53.2%，以土霉素为主；而大环内酯类化合物的总含量在0～1 052.8 μg·kg-1之间，平均为46.9 μg·kg-1，检出率最低为25.9%，以泰乐菌素为主.在鸡粪中，四环素类化合物的总含量在0～2 839.3 μg·kg-1之间，平均为159.3 μg·kg-1，检出率最低为57.1%，以金霉素为主；而大环内酯类化合物的总含量在0～845.2 μg·kg-1之间，平均为28.1 μg·kg-1，检出率最低为14.3%，以北里霉素为主.在猪粪和鸡粪中两类化合物的分布特征存在差异，猪粪中两类抗生素的总含量均较高的地区为琼海市和临高县，鸡粪中两类抗生素的总含量均较高的地区为儋州市和琼海市.

畜禽粪； 四环素类； 大环内酯类； 抗生素； 残留

兽用抗生素是用于动物疾病的预防和治疗，以加快其生长和提高其经济效益的一类物质，其中四环素类(TCs)和大环内酯类(MLs)抗生素近年来被广泛应用于畜禽养殖业[1-2].研究表明，抗生素在动物体内只有少部分被吸收和利用，绝大部分则未被代谢而随排泄物进入污水或环境中[3].由于排泄物中的抗生素含量普遍较高，因此它现在已成为环境污染的重要来源[4].这些粪便80%以上未进行分解就被直接施用于菜地、果园和农田[5]，这既破坏了土壤微生物的平衡[6]，又促进了细菌耐药性的产生[7]，它被农作物吸收和积累后[8]，会造成食品的抗生素污染[9]，最终危害人类的健康.

海南省作为一个农业省份，畜牧业在其中发挥着重要的作用，所以畜禽粪便中抗生素的残留问题是不容忽视的，然而目前有关海南省畜禽粪中抗生素残留的状况却鲜有报道.为此，本研究针对畜牧养殖中普遍使用的四环素类和大环内酯类抗生素，分析了在海南省不同地区的规模化养殖场中抗生素在鸡/猪粪便中的残留情况，旨在为控制抗生素污染和评估农业环境提供基础的数据[4].

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 高效液相色谱仪(型号为LC-20AD)，配有紫外检测器(型号为SPD-M20A)，自动进样器(型号为SIL-20A)，购自SHIMADZU公司；电子天平(型号为XPE105)，购自METTLER TOLEDO公司；隔膜真空抽滤机(型号为GM-0.5A)，购自天津市津腾实验设备有限公司；氮氢空发生器(型号为QPT-300Ⅱ)，购自上海全浦科学仪器有限公司；Waters Oasis HLB固相萃取小柱，购自海南一鼎生物科技有限公司；超声波清洗器(型号为SB-80)，购自上海卓博精密机械有限公司；高速冷冻离心机(型号为Centrifuge5418)，购自Eppendorf公司.

金霉素标准品(纯度≥94.6%)、北里霉素标准品(纯度≥92.0%)、泰乐菌素标准品(纯度≥96%)，均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；土霉素对照品(纯度≥88.8%)，购自中国药品生物制品检定所.甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，均购自TEDLA公司；磷酸二氢钠、柠檬酸、磷酸氢二钠等均为国产分析纯.

抗生素标准溶液：取各种抗生素标准品1 mg溶于甲醇中，并定容至10 mL，得到混合标准品母液，于4℃保存，然后按需要稀释成各质量浓度梯度.

1.2 样品采集 鸡和猪粪便见表1，其采自海南省不同地区的鸡/猪养殖场，共126份样品，其中鸡粪便49份，猪粪便77份.新鲜样品经冷冻(-80℃)、干燥、粉碎、筛滤(80目)后备用.

表1 畜禽粪便样品

1.3 样品的预处理 抗生素的提取：取1.00 g处理后的粪样溶于10 mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液中，超声20 min，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，反复2次，合并上清液，每个样品设定2组平行.

固相萃取：丙酮、甲醇、超纯水各5 mL活化HLB小柱，上清液过柱(5 mL·min-1)，先以φ=5%的甲醇水溶液(8 mL)冲洗小柱，然后用二氯甲烷(10 mL)洗脱，接着用氮气(40℃)吹至近干，将其溶于1 mLφ=20%的甲醇水溶液中，最后用有机滤膜(0.22 μm)过滤，待测.

1.4 高效液相色谱的分析条件和质量控制 Hypersil BDS C18色谱柱(5 μm，4.6 m×250 mm)，柱温40 ℃；进样量10 μL；流动相A为0.01 mol·L-1的磷酸二氢钠溶液，B为乙腈，流速为1.0 mL·min-1；梯度洗脱程序：流动相B开始占比为22%，7 min时上升到80%，10 min时降到22%，全程运行10 min.

将混合标准品母液以二倍稀释法逐级稀释，得到标准梯度质量浓度为5 000，2 500，1 250，625，312，156 ng·mL-1的4种抗生素混合标准溶液，做标准曲线，其线性方程的R2都大于0.999(见表2).测得样品在三个添加水平下的回收率为76.9%～96.7%，相对标准偏差为1.7%～7.7%，检测限为0.02～0.05 μg·kg-1.样品检测色谱图见图1.

表2 抗生素的液相色谱分析和线性方程

2 结果与分析

2.1 猪粪中四环素类和大环内酯类抗生素的残留特征

2.1.1 含量特征 由表3可见，在猪粪样品中，四环素类化合物的总含量在0～8 460.8 μg·kg-1之间，平均含量为385.4 μg·kg-1，最低检出率为53.2%，其中土霉素被检出的平均含量和检出率均高于金霉素被检出的平均含量和检出率；大环内酯类化合物的总含量在0～1 052.8 μg·kg-1之间，平均为46.9 μg·kg-1，最低检出率为25.9%，其中，泰乐菌素被检出的平均含量和检出率均高于北里霉素被检出的平均含量和检出率.由此可知，四环素类化合物的平均含量和检出率均高于大环内酯类的平均含量和检出率，因此其污染程度也高于大环内酯类化合物的污染程度.

表3 猪粪(干重)中四环素类和大环内酯类化合物的含量 μg·kg-1

注：ND为未检出，以数值0计算.

2.1.2 空间分布特征 图2为不同地区猪粪中四环素类抗生素总含量的空间分布特征，由图2可知，不同地区猪粪中四环素类总含量由高到低的顺序为：琼海市>屯昌县>临高县>万宁市>儋州市>昌江县>东方市>三亚市>陵水市>乐东县，其中，琼海市、屯昌县、临高县均高于500 μg·kg-1，三亚市、陵水市、乐东县的总含量大体相当，且均低于300 μg·kg-1.大环内酯类抗生素的总含量的空间分布特征见图3，其总含量由高到低的顺序为：临高县>万宁市>琼海市>屯昌县>乐东县>三亚市>昌江县>陵水市>儋州市 >东方市，其中，临高县和万宁市的总含量相对较高，均高于70 μg·kg-1，乐东县、三亚市、昌江县、陵水市的总含量大体相当，含量均在40 μg·kg-1左右.因此，在琼海市和临高县猪粪中，四环素类和大环内酯类抗生素的总含量较高，在陵水市和东方市的猪粪中，四环素类和大环内酯类抗生素的总含量则较低.

2.2 鸡粪中四环素类和大环内酯类抗生素的残留特征

2.2.1 含量特征 由表4可见，在鸡粪样品中，四环素类化合物的总含量在0～2 839.3 μg·kg-1之间，平均含量为159.3 μg·kg-1，最低检出率为57.1%，其中，金霉素的平均含量低于土霉素的平均含量，而其检出率却高于土霉素的检出率；大环内酯类化合物的总含量在0～845.2 μg·kg-1之间，平均含量为28.1 μg·kg-1，最低检出率为14.3%，其中，北里霉素的平均含量和检出率较泰乐菌素的高.由此可知，四环素类化合物的平均含量和检出率均较大环内酯类化合物的高，因此，其污染程度也高于大环内酯类化合物的污染程度.

表4 鸡粪(干重)中四环素类和大环内酯类化合物的含量 μg·kg-1

注：ND为未检出，以数值0计算.

2.2.2 空间分布特征 在不同地区的鸡粪中，四环素类抗生素的总含量的空间分布特征见图4.由图4可知，四环素类抗生素的总含量由高到低的顺序为：儋州市>屯昌县>琼海市>临高县>昌江县>万宁市.其中，儋州市的总含量高于200 μg·kg-1，屯昌县、琼海市、临高县和昌江县的总含量大体相当，均在150 μg·kg-1左右.不同地区鸡粪中大环内酯类抗生素的总含量的空间分布特征见图5，其总含量由高到低的顺序为：儋州市>琼海市>万宁市>屯昌县>临高县>昌江县.儋州市和琼海市的总含量大体相当，均高于40 μg·kg-1，而临高县和昌江县均低于20 μg·kg-1.因此，在儋州市和琼海市的鸡粪中，其四环素类和大环内酯类抗生素的总含量均较高，在临高县和昌江县的鸡粪中，其四环素类和大环内酯类抗生素的总含量均较低.

3 讨 论

本研究调查了海南省不同地区典型养殖场鸡/猪粪便中2种四环素类(TCs)和2种大环内酯类(MLs)抗生素的污染特征.相关研究表明[10～12]，粪便中各类抗生素的含量最高能达到mg·kg-1级，在研究中，仅四环素类抗生素的最高检出含量能达到mg·kg-1级，而大环内酯类的含量相对较低，其含量的差异可能与畜禽饲养中用药方案的不同有关.根据农业部168公告——《饲料药物添加剂使用规范》，常用抗生素在作为饲料药物添加剂以助生长时，其含量较低，而当其被用于疾病治疗时，其添加量则较高，以北里霉素为例，在鸡饲料中作为促生长的添加剂时，其重量百分浓度为5×10-6～11×10-6，而在其被用于疾病治疗时，其重量百分浓度高达1×10-4～3.3×10-4；在猪饲料中作为促生长添加剂时，其重量百分浓度为5×10-6～5.5×10-5，而在其被用于疾病治疗时，其重量百分浓度却高达8×10-5～3.3×10-4，因此，不同的用途会导致畜禽粪便中抗生素含量的不同.此外，对于不同生长期的猪与不同种类的鸡，其用药方案不同也会导致粪便中抗生素的含量和种类出现差异，如哺乳猪和断奶仔猪，由于其免疫力和抵抗力较弱，容易感染细菌性疾病，因此在饲养过程中，抗生素使用的种类和数量较多，使用周期较长，使用频率亦较高，从而致使其粪便中抗生素的含量相对较高，种类也相对较多；又如育肥猪，由于其免疫力和抵抗力较强，因而其感染细菌性疾病的几率较小，同时抗生素对其的促生长作用较弱，此时，为了减轻经济负担，一般使用较少，故其粪便中所检测出的抗生素的含量和种类相对于仔猪要少；对于孕期母猪，用药方案通常较为谨慎，一般在细菌感染后，多用中草药和其他治疗方法，因此，其粪便中抗生素的含量和种类相对较低或较少[13].在肉鸡和蛋鸡饲料中添加抗生素均可提高生产性能，但使用于肉鸡多为了增重，而使用于蛋鸡则多为提高产蛋率.总之，为了达到不同目的和提高经济效益，常会采用不同的用药方案，这些均会导致粪便中抗生素的含量和种类不同.

由于地理环境的差异，不同地区会采用不同的养殖方式，因此其畜禽粪便中抗生素的含量亦有所差异.在本文所调查的地区，其养殖方式多为散养和圈养，散养的畜禽大多是从自然界中获得新鲜的草料以及活虫来作为食物，其活动量大，肉质鲜美，但容易感染细菌性疾病，且多用抗生素来治疗，这种养殖方式的粪便不集中，难处理，会对环境造成污染；而圈养畜禽多以饲料为食物，其活动量小，消耗少，增膘快，而且为提高经济效益，其饲料中多添加抗生素以促进生长和预防疾病，因此在不同养殖方式下的畜禽粪便中，抗生素的含量会有所不同.

抗生素随粪便进入环境后大多数都不会被处理，它通常是随着粪便被直接作为粪肥而施于农田、果园和菜园，并随农田灌溉系统进入土壤和地下水环境，也可经雨水淋洗而进入河流或湖泊等水体，从而对土壤和水体造成污染[14].Batt等的研究发现，粪肥施于土壤22天后，在土壤表层0～5 cm处就能检测到四环素类抗生素的存在，且其含量高达281.34 mg·kg-1[15].Kong等的研究表明，抗生素会对土壤环境中微生物群落的多样性带来负面影响[16].微生物群落多样性的减少会导致土壤和粪肥中的有机质不能更好地腐烂和分解，从而影响土壤的肥力，使植物的生长受到抑制，甚至死亡，最终打破原有的生态平衡[17].进入水体中的抗生素会破坏水中的微生物平衡，同时它还会对水中生物的生长造成影响.Sanderson等研究了226种抗生素对水生生物的危害性，结果表明：抗生素对藻类、大型溞、鱼类等都具有毒性，但对不同物种其毒性程度不同[18].环境中的细菌长期在低浓度抗生素的压迫下，其基因容易发生突变，从而产生耐药性[19].耐药菌质粒在不同生物之间的水平传播会使环境易获得具有该质粒的细菌而产生耐药性，而这些耐药菌以病原体的形式感染人体后会影响对人体疾病的治疗[20].所以，在饲养过程中若不遵守休药期或长期使用抗生素作为饲料添加剂，那么就会导致动物性食品的药物残留，当人长期食用具有药物残留的肉、蛋等动物性食品时，其肠道微生物平衡会遭到破坏，同时其肠道细菌也可能产生耐药性，这会增加治疗人类细菌性疾病的难度，同时也可能会引起一系列的其他疾病，如器官病变等，此外，对于具有过敏体质的个体，低剂量的药物残留还可能引起变态反应，也可能使青少年生长发育受到影响[21].

4 结 论

在海南省的畜禽粪便中，四环素类化合物的平均总含量和检出率均高于大环内酯类化合物的平均总含量和检出率.在猪粪和鸡粪中，这两类化合物的空间分布特征存在差异，猪粪中这两类抗生素的总含量均较高的地区为琼海市和临高县；鸡粪中这两类抗生素的总含量均较高的地区为儋州市和琼海市.为避免抗生素残留对环境以及人体造成危害，必须加强抗生素的管理和使用规范，应建立起一套药物残留的监控体系，制定违规的相应处罚手段，同时应探索安全、高效和经济的饲料添加剂，这一点显得尤为重要.但考虑到目前抗生素残留的检测方法和步骤较为繁琐、资金花费也较大，因此建议使用高温堆肥[22]，这样故可降低粪便中抗生素的含量，此外，还可根据不同类型抗生素的性质，优化堆肥的过程和条件，培育、驯化和筛选出耐高温的抗生素降解菌，以此来提高抗生素的降解效率.

[1] 刘 君,韩志强. 兽用抗生素的应用及监管对策[J].当代畜牧,2016(6):30-31.

[2] 王 瑞,魏源送. 畜禽粪便中残留四环素类抗生素和重金属的污染特征及其控制[J].农业环境科学学报,2013,32(9):1705-1719.

[3]Sarmah A K,Meyer M T,Boxall A B A. A global perspective on the use,sales,exposure pathways,occurrence,fate and effects of veterinary antibiotics(VAs) in the environment[J]. Chemosphere,2006,65(5):725-759.

[4] 刘 锋,廖德润,李 可,等. 畜禽养殖基地磺胺类喹诺酮类和大环内酯类抗生素污染特征[J].农业环境科学学报,2013,32(4):847-853.

[5] 史 奕,赵牧秋,王 俊, 等. 设施菜地土壤-植物系统中有机肥源抗生素的影响研究进展[J].农业环境科学学报,2010,29:240-244.

[6] Ding C, He J Z. Effect of antibiotics in the environment on microbial populations[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2010,87(3):925-941.

[7] Wu N,Qiao M,Zhang B,et al. Abundance and diversity of tetracycline resistance genes in soils adjacent to representative swine feedlots in China[J].Environmental Science & Technology,2010,44(18):6 933-6 939.

[8] Migliore L,Cozzolino S, Fiori M. Phytotoxicity to and uptake of enrofloxacin in crop plants[J]. Chemosphere,2003,52(7):1 233-1 244.

[9] 潘 炜,王春燕. 关注抗生素对食品的污染[J].中国质量技术监督,2005(6):42-43.

[10] Martines-Carballo E, Gonzales-Barreiro C, Scharf S, et al. Environmental monitoring study of selected veterinary antibiotics in animal manure and soils in Austria[J]. Environ Pollut,2007,148(2):570-579.

[11] Zhao L, Dong Y H, Wang H. Residues of veterinary antibiotics in manures from feedlot livestock in eight provinces of China[J].Sci Total Environ,2010,408(5):1 069-1 075.

[12] Christian T, Schneider R J, Farber H A,et al. Determination of antibiotic residues in manure, soil, and surface wates[J]. Acta Hydrochimica Et Hydrobiologica,2003,31(1):36-44.

[13] 夏利宁, 赵红琼, 程婷婷,等. 新疆某猪场不同生长期的猪源大肠杆菌对抗生素耐药性调查[J]. 中国畜牧兽医,2013,40(3):216-220.

[14] 王兰. 抗生素污染现状及对环境微生态的影响[J]. 药物生物技术,2006,13(2):144-148.

[15] Batt A L, Bruce I B, Aga D S. Evaluating the vulnerability of surface waters to antibiotic contamination from varying wastewater treatment plant discharges[J]. Environmental Pollution,2006,142(2):295-302.

[16]Kong W D, Zhu Y G, Fu B J, et al. The veterinary antibiotic oxytetracycline and Cu influence functional diversity of the soil microbial community[J]. Environmental Pollution, 2006,143(1):129-137.

[17] 邰义薄, 莫测辉, 李彦文,等. 长期施用粪肥菜地土壤中四环素类抗生素的含量与分布特征[J].环境科学,2011,32(4):1 182-1 187.

[18] Sanderson H, Brain R A, Johnson D J, et al. Toxicity classification and evaluation of four pharmaceuticals classes: antibiotics, antineoplastics, cardiovascular, and sex hormones[J].Toxicology,2004,203(1-3):27-40.

[19] Halling-SΘrensen B. Inhibition of aerobic growth and nitrification of bacteria in sewage sludge by antibacterial agents[J]. Archives of Environmental Contamination & Toxicology, 2001,40(4):451-460.

[20] Andreozzi R, Caprio V, Ciniglia C, et al. Antibiotics in the environment: occurrence in Italian STPs, fate, and preliminary assessment on algal toxicity of amoxicillin[J]. Environmental Science & Technology,2015,38(38):6 832-6 838.

[21] 胡登兵,丁新建, 张焕容. 兽药残留危害及国内外一般控制措施[J]. 四川畜牧兽医,2008,35(1):12-13.

[22] 潘兰佳,唐晓达,汪印. 畜禽粪便堆肥降解残留抗生素的研究进展[J].环境科学与技术,2015,38(12):191-198.

Distribution Characteristic of Tetracycline and Macrolide Antibiotics Contents in Swine and Chook Manures of Hainan Province

Yao Qian, Gao Linglin, Jiang Yalei, Yang Yuhui, Wang Xuemei

(College of Tropical Forestry, Hainan University, Haikou 570228, China)

In the report, solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography (HPLC) were performed to detect the occurrence and distribution of two tetracyclines and two macrolides in swine and chook feces sampled from large scale feeding operations in different areas of Hainan province. The results indicated that the average content and detection rate of tetracyclines compounds were higher than that of macrolides. The total concentrations of tetracyclines ranged from 0 μg·kg-1to 8 460.8 μg·kg-1(F. W.) with an average of 385.4 μg·kg-1, the lowest detection rate was 53.2% in all swine dung samples. The dominant compounds in swine manures were oxytetracycline. The total concentrations of macrolides ranged from 0 μg·kg-1to 1 052.8 μg·kg-1(F. W.) with an average of 46.9 μg·kg-1, the lowest detection rate was 25.9% in all swine dung samples. The dominant compound in swine manures was tylosin. The total concentrations of tetracyclines ranged from 0 μg·kg-1to 2 839.3 μg·kg-1(F. W.) with an average of 159.3 μg·kg-1, the lowest detection rate was 57.1%. The dominant compound in chook manures was aureomycin. And macrolides ranged from 0 μg·kg-1to 845.2 μg·kg-1(F. W.) with an average of 28.1 μg·kg-1, the lowest detection rate was 14.3% in all chook dung samples. The dominant compound in chook manures was kitasamycine. There were significant differences among the distribution characteristics of both compounds in swine and chook dungs, the amounts of two kinds of antibiotics in swine dungs from Qionghai and Lingao were higher than that of other places in Hainan, the amounts of two kinds of antibiotics in chook dungs from Danzhou and Qionghai were higher than that of other places in Hainan.

manures; tetracyclines; macrolides; antibiotics; remain

2017-02-24

海南省科技厅“产、学、研一体化”项目(cxy20150021)

姚倩(1992- )，女，山西运城人，海南大学热带农林学院2015级硕士研究生，E-mail: 996714594@qq.com

杨雨辉(1971- )，男，黑龙江绥化人，博士、教授，研究方向为兽医药理与毒理，E-mail: yanguniverse@sina.com

1004-1729(2017)02-0152-07

X592

A DOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2017.0024