鞍带石斑鱼、棕点石斑鱼及其杂交子代DNA甲基化的MSAP分析

周 莹， 韩玉龙， 骆 剑， 王 茜， 陈国华

(南海海洋资源利用国家重点实验室，海南大学 海洋学院，热带生物资源教育部重点实验室，海南 海口570228)

鞍带石斑鱼、棕点石斑鱼及其杂交子代DNA甲基化的MSAP分析

周 莹， 韩玉龙， 骆 剑， 王 茜， 陈国华

(南海海洋资源利用国家重点实验室，海南大学 海洋学院，热带生物资源教育部重点实验室，海南 海口570228)

为了探究海洋鱼类杂交优势的产生机制，以鞍带石斑鱼、棕点石斑鱼及其杂交子一代石斑鱼为研究对象，采用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术对三个群体的基因组DNA的胞嘧啶甲基化修饰水平进行了研究.实验结果显示，棕点石斑鱼、鞍带石斑鱼、杂交子一代石斑鱼的基因组DNA的总甲基化率分别为57.18%，63.16%，54.76%，在石斑鱼亲本的基因组中，其DNA的甲基化程度较高，而在杂交子代中，其DNA的甲基化程度较低.三个群体的DNA全甲基化率分别为31.66%，39.71%，40.00%，半甲基化率分别为25.52%，23.44%，14.76%，杂交子代的半甲基化率显著低于亲本的半甲基化率.研究表明，鞍带石斑鱼与棕点石斑鱼的杂交子代在基因组层面上和双亲相比发生了较大的甲基化水平的调整，于不同位点，DNA甲基化的增强或减弱对石斑鱼杂种优势可能会产生影响.

石斑鱼； DNA甲基化； 甲基化敏感扩增多态性； 杂种优势

石斑鱼隶属鲈形目、鮨科、石斑鱼属，属暖水性鱼类，主要分布在热带及亚热带海区，属世界名贵海水鱼类，其在我国南部沿海地区均有广泛养殖，具有较高的经济效益.但近年来，由于过度捕捞和其栖息地遭到破坏，从而造成野生石斑鱼的种群规模缩小和种质资源退化，致使石斑鱼优良品种缺乏，这已成为制约养殖产业发展的瓶颈因素[1-2].采用远缘杂交的方法来获得具有杂种优势的子一代是快速有效的品种改良方式.石斑鱼种类众多，由于揭示石斑鱼杂种优势的主要作用机制是开展杂交育种工作的重要基础，因此选择合适的亲本杂交组合就成为培育石斑鱼优良杂种的关键.

杂种优势的机制包括“显性说”、“超显性说”和“上位效应说”等，它们均在一定程度上揭示了杂种优势产生的机制，这些机制主要源于亲本之间的基因型差异.Romagnoli等[3]的研究证实了玉米杂种根尖中的基因差异表达与杂种优势的关联，不仅如此，越来越多的研究亦表明了基因表达差异对于杂种优势的作用[4-5].DNA甲基化作为主要的基因表观修饰方式之一，其程度的改变已被证实会对高等动植物的杂种优势产生显著的作用[6-7].

棕点石斑鱼(E.fuscoguttatus)俗称老虎斑，其生长速度较慢，饲养时间长，但是抗病力强；鞍带石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)又称龙趸石斑鱼，其肉质鲜美，体型较大，生长速度快.以棕点石斑鱼为母本和以鞍带石斑鱼为父本进行杂交所得到的杂种子一代具有“虎斑头、龙胆尾”的外型，其集母本抗病力强和父本生长速度快等优点于一身，适应环境能力强，体长增长比母本棕点石斑鱼快35.9%，体重增长快114.5%，显示出较强的杂种优势[8-9].本实验以该杂交组合为研究对象，采用MSAP技术来分析鞍带石斑鱼、棕点石斑鱼和其杂交子一代间DNA甲基化水平的差异，研究了DNA甲基化与杂种优势的关系，旨在揭示石斑鱼杂种优势的机理和为杂交育种提供理论支持.

1 材料与方法

1.1 材 料 实验材料取自海南陵水石斑鱼养殖基地，选取了棕点石斑鱼♀×鞍带石斑鱼♂的杂交子代幼鱼群体，以母本棕点石斑鱼群体自交的子代幼鱼群体和父本鞍带石斑鱼群体自交的子代幼鱼群体为样本.每个群体分别随机选取30尾，取尾鳍组织固定于φ=95%的酒精中，并带回实验室，于-20 ℃保存备用.

1.2 方 法

1.2.1 基因组DNA的提取 采用TIANGEN的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取样品DNA，并以w=1%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量，于-20℃保存.

1.2.2 双酶切反应 对于每份DNA，同时设置EcoRI+HpaII(以下记作H组)和EcoRI+MspI(以下记作M组)两种酶切反应，反应体系包括基因组500 ng DNA，5 U EcoRI，5 U HpaII/MspI，4 μL 10×Buffer Tango，加灭菌双蒸水补足至20 μL.37 ℃水浴酶切6 h，转65 ℃酶切变性10 min，最后用w=1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测.

1.2.3 连接接头 连接体系为20 μL，包括5 μL酶切产物，1 μL E接头，1 μL HM接头，5 U T4DNA Ligase，4 μL 5×T4DNA Ligase Buffer，加灭菌双蒸水补足至20 μL.16 ℃连接过夜，产物稀释10倍以用于预扩增.

1.2.4 预扩增反应 反应总体系为20 μL，其中含2 μL稀释连接产物，1 μLE0和HM0预扩引物，2 μL 2.5 mmol·L-1的 dNTPs，2 μL 10×Taq Buffer以及2 U Taq DNA Polymerase，加灭菌双蒸水补足至20 μL.预扩增程序为94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共进行20个循环，72 ℃10 min.最后用w=2%的琼脂糖凝胶电泳检测，产物稀释20倍后用于选择扩增.

1.2.5 选择性扩增反应 反应总体系为20 μL，包括4 μL预扩增稀释产物，1 μL En选扩引物和HMn选扩引物，2 μL 2.5 mmol·L-1的dNTPs ，2 μL 10×Taq Buffer以及2U Taq DNA Polymerase，加灭菌双蒸水补足至20 μL.选择扩增程序为94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，56～65 ℃ 30 s(-0.7℃/cycle)，72 ℃ 1 min，循环14次；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环23次，72 ℃ 5 min，16 ℃ 保存.最后用w=2%的琼脂糖凝胶电泳检测，产物稀释10倍.

实验所用的接头和引物组合见表1，根据使用所有选扩引物扩增的结果，筛选出8对重复性好、多态性好、条带清晰的选择扩增引物组合以用于本实验的研究，8对引物组合分别是：选引2—E1HM2，选引5—E1HM5，选引6—E2HM1，选引7—E2HM2，选引8—E2HM3，选引12—E3HM2，选引13—E3HM3，选引17—E4HM2.

表1 所用接头和引物序列

1.2.6 产物检测 采用JY-CX2B型电泳槽进行6%变性聚丙烯酰氨凝胶电泳，选扩稀释产物与上样缓冲液以2 ∶1的比例混合，95 ℃变性10 min，立即置于冰上待用.采用70 W恒功率预电泳1 h，取4 μL已变性产物，在70 W恒功率下电泳2 h，电泳结束后进行银染.

1.2.7 数据统计与分析 在MSAP图谱上，对于同一样品的DNA，分别用HpaII和MspI与EcoRI组合进行双酶切，因此每个样品对应2个泳道，在同一位点，有条带计为“1”，无条带计为“0”.统计8对引物扩增出的条带数及带型数，根据扩增产物在2个泳道内的有无的情况，可以将条带类型分为4种：(1)A型：H、M两个泳道都有带，即“H/M”带型为“1、1”，其表示该酶切位点没有发生甲基化，代表去甲基化位点；(2)B型：H泳道有带，M泳道无带，即“H/M”带型为“1、0”，其表示该酶切位点为单链外甲基化，代表半甲基化位点；(3)C型：H泳道无带，M泳道有带，即“H/M”带型为“0、1”，其表示该酶切位点为双链内甲基化，代表全甲基化位点；(4)D型：H、M两个泳道都无带，即“H/M”带型为“0、0”，此时有三种情况，即表示该酶切位点存在双链外侧甲基化、双链内外侧甲基化或无CCGG序列，此类型位点不做统计.将得到的甲基化条带进行统计，计算各个群体的总甲基化率、全甲基化率及半甲基化率.DNA甲基化的计算方法：全甲基化率=全甲基化条带数/总扩增带数×100；半甲基化率=半甲基化条带数/总扩增带数×100；总甲基化率=全甲基化率+半甲基化率.

2 结 果

2.1 杂交子一代群体的基因组DNA提取及双酶切 MSAP对DNA的质量要求较高，本实验提取的杂交子一代的DNA琼脂糖凝胶(w=1%)电泳图如图1所示，基因组DNA的样本基本无RNA及蛋白质污染，质量较高.经EcoRI+HpaII和EcoRI+MspI双酶切后，杂交子一代的DNA酶切产物呈一片均匀分布的“Smear”带，表明酶切充分，符合MSAP对酶切的要求，见图2.

2.2 预扩增 杂交子一代基因组DNA双酶切后，连接接头，连接产物经预扩增后，用w=1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，产物条带大致呈弥散状，其在100～1 000 bp之间稳定存在，扩增效果较好.

2.3 选择扩增 首先预扩增稀释产物，用筛选出的8对选扩引物组合进行选择性扩增，用w=2%的琼脂糖凝胶电泳检测选扩效果，产物条带区主要分布在低分子量区，重复性好、多态性好、条带清晰.图4是杂交子一代群体选扩引物2的琼脂糖凝胶(w=2%)电泳图.

2.4 三个石斑鱼群体的甲基化图谱 用选扩引物2扩增的产物对三个石斑鱼群体进行聚丙烯酰氨凝胶电泳，其扩增结果如图5所示，结果显示了DNA甲基化的三种不同类型的条带，即“H/M”带型为“1、1”(A)，“H/M”带型为“1、0”(B)，“H/M”带型为“0、1”(C)三种条带类型.由图5中可以看出，每个石斑鱼群体的DNA甲基化带型都非常丰富，三种DNA甲基化带型均有出现.

2.5 亲子代间DNA的甲基化水平 8对引物对3个群体的扩增结果显示，棕点石斑鱼、鞍带石斑鱼、杂种子一代扩增出的总条带数分别为5 117，6 270，6 300.其中，甲基化总条带数分别为2 926，3 960，3 450.母本棕点石斑鱼群体的甲基化率平均为57.18%，其中全甲基化率为31.66%，半甲基化率为25.52%；父本鞍带石斑鱼群体的甲基化率平均为63.16%，其中全甲基化率为39.71%，半甲基化率为23.44%；杂交子一代群体的甲基化率平均为54.76%；其中全甲基化率为40.00%，半甲基化率为14.76%(见表2).亲子代间的DNA甲基化水平存在较大的差异.

3 讨 论

3.1 DNA甲基化水平与杂种优势的相关分析 DNA甲基化作为真核生物基因组重要的表观遗传学修饰，被认为是杂种优势产生的重要机制.1997年，Reyna-López等[10]首次报道了MSAP技术，近年来，该技术日益成熟，由于其操作简单和具有高效性，因此它已被广泛应用于动植物基因组DNA甲基化水平的研究中.仪治本等[11]分析了三个高粱(Sorghum)杂交种及其相应亲本的DNA甲基化水平，结果显示：这三个杂交种的DNA甲基化水平(41.8%，47.6%，48.7%)都低于双亲的DNA甲基化水平(51.4%～63.0%).李爱等[12]也在落叶松(Larix)中发现其正反交的优势杂交子代的DNA甲基化水平(20.46%，19.92%)显著低于中亲值(22.99%).刘天娇[13]在玉米(ZeamaysL)杂交种中也发现其DNA甲基化水平显著降低.在牛(Bostaurus)[14]、猪(Susdomesticus)[15]、鲤鱼(Cyprinuscarpio)和鲫鱼(Carassiusauratus)[16]等动物的杂种优势中也普遍存在DNA甲基化水平的改变.于涛等[17]在扇贝杂交的研究中发现，母本栉孔扇贝(Chlamysfarreri)的甲基化率为24.13%，父本虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)的甲基化率为32.79%，而杂交子一代的甲基化率为19.98%，子代的DNA甲基化率低于亲本的DNA甲基化率.上述动植物杂种优势的研究显示，其杂种一代的甲基化程度比亲本的甲基化程度低，由此认为：甲基化程度的降低是杂种优势的原因之一[18-19].

表2 杂交亲子代间的DNA甲基化水平比较

DNA甲基化与基因表达有关，杂交子一代在基因组水平上发生DNA甲基化水平的降低可能会导致部分沉默基因的开启，这种结果可能导致杂种的潜在适应性提高，从而产生高于亲本的优势.本研究在棕点石斑鱼、鞍带石斑鱼及杂交子一代中建立了MSAP方法的反应体系，获得了清晰、稳定的扩增图谱.实验结果表明，棕点石斑鱼、鞍带石斑鱼、杂交子一代石斑鱼的基因组DNA总甲基化率分别为57.18%，63.16%，54.76%，杂种子代的总甲基化率低于亲本的总甲基化率.这与其他研究所发现的杂种一代的甲基化程度比亲本的甲基化程度低的结果相一致，说明在具备杂种优势的子代石斑鱼中，其甲基化水平也显著地降低，推测这有利于杂种优势的形成.

3.2 杂交优势与甲基化水平的关系存在物种差异 本文在石斑鱼杂交子一代约6 000个位点的分析结果显示，棕点石斑鱼、鞍带石斑鱼、杂交子一代石斑鱼的基因组DNA总甲基化率分别为57.18%，63.16%，54.76%.相较于部分动植物的基因组DNA甲基化水平，如毛竹(Phyllostachysheterocyclavar.pubescens)[20](24.44%～32.12%)、泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)[21](20.8%～24.1%)、背角无齿蚌(Anodontawoodiana)[22](35.5%～56%)，以及哺乳动物如牛[14](33.1%～40.03%)、猪[15](40.6%～44.8%)等来说，本文中的石斑鱼群体的基因组DNA甲基化水平属于程度较高的类群，尽管杂交子一代的甲基化水平仍然较高，但却获得了明显的杂种优势.实验得到石斑鱼杂交子一代的半甲基化率(14.76%)显著低于亲本群体的半甲基化率(25.52%和23.44%)，然而其全甲基化率却为40.00%，显著高于母本的全甲基化率(31.66%)，与父本的全甲基化率(39.71%)相近.这不同于在扇贝[17]和牛[14]中所得到的杂交后代的全甲基化率(其低于亲本)，但是与亲子代间的DNA全甲基化水平均大于半甲基化水平这一结果相符合.这一方面说明基因组DNA甲基化水平的高低存在物种的差异性；另一方面也提示杂种子代的DNA甲基化水平相对降低对杂种优势更具意义.

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Methylation-sensitive Amplification Polymorphism Analysis of Genomic DNA Methylation onEpinepheluslanceolatus,Epinephelusfuscoguttatusand Their Hybrid Generation

Zhou Ying, Han Yulong, Luo Jian, Wang Qian, Chen Guohua

(State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea, Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education, Hainan University, Haikou 570228, China)

To investigate the generation mechanism of heterosis in fish hybrids,Epinephelusfuscoguttatus,Epinepheluslanceolatusand their hybrids populations were used as the objects of research, methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP) was used to analyze the DNA cytosine methylation of their genome. The results showed that the MSAP values of the three groups were 57.18%, 63.16%, and 54.76%, respectively. The full-methylation ratios of these populations were 31.66%, 39.71% and 40.00%, respectively, and the half-methylation ratios were 25.52%, 23.44%, and 14.76%, respectively. Compared with their parental lines, the DNA methylation level of the hybrids was changed significantly, and at the different sites, the heterosis of the groupers should benefit from the DNA methylation and DNA demethylation.

grouper; DNA methylation; MSAP; heterosis

2017-02-26

国家“863”计划项目(2012AA10A407)，海南省重点研发项目(ZDYF2016085).

周莹(1992-)，女，河北邯郸人，海南大学海洋学院2014级硕士研究生，E-mail:1499364556@qq.com

骆剑(1980-)，男，湖南衡山人，副教授，硕士生导师，研究方向：鱼类生殖与遗传. E-mail:luojianfish@aliyun.com

1004-1729(2017)02-0145-07

S 917.4

A DOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2017.0026