孕35～37周妇女无乳链球菌携带状况及不同方法检出情况分析

闫津津 王子璇

孕35～37周妇女无乳链球菌携带状况及不同方法检出情况分析

闫津津 王子璇

目的了解孕35～37周妇女阴道无乳链球菌（GBS）携带情况以及不同方法检出状况。方法持续采集北京大学深圳医院产检门诊孕35～37周孕妇阴道分泌物，采用细菌生化鉴定仪（vitek 2）、质谱鉴定技术和显色培养基对GBS进行鉴定。结果共收集阴道分泌物拭子1018例，分离出GBS 112株，总分离率为11.0%。112株GBS vitek 2鉴定112例，质谱鉴定112例，显示培养基显示110例，3种鉴定方法的检出率分别为11.0%、11.0%、10.8%；正确率分别为100.0%、100.0%、98.2%。结论3种鉴定方法对GBS的鉴定结果符合率均较高，显色培养法可作为孕晚期妇女快速筛查GBS的方法，vitek 2和质谱鉴定技术作为最终确证。

无乳链球菌；细菌生化鉴定仪；质谱鉴定；显色培养基

无乳链球菌（streptococcus agalactiae,GBS），是一种链状排列的革兰阳性球菌，过氧化氢酶阳性[1]。GBS通常被称为B群链球菌，可引起新生儿肺炎、产褥感染以及脑膜炎等。GBS感染与胎膜早破、早产、新生儿败血症等有关，母婴垂直传播与大部分新生儿感染GBS密切相关，女性生殖道GBS检测及药敏分析至关重要。在生产过程中GBS通过产道传播给新生儿，主要引起新生儿肺炎、脑膜炎等[2]，病死率为5%左右，存活下来的新生儿可发生严重神经系统后遗症，如智力缺陷、视觉或听觉障碍。中国孕妇GBS携带率与国外相当，为6.5%～30.0%[3]。美国疾病预防控制中心（CDC）建议在分娩过程中使用抗生素以预防孕妇阴道分泌物中分离出的GBS。CDC的建议提出后，早期（产后1周）的GBS感染病死率逐渐降低。青霉素和氨苄西林是治疗GBS的首选药物，若青霉素过敏，根据药敏试验可选用红霉素和克林霉素。由于预防用药，大约20%GBS携带者中产生了红霉素和克林霉素耐药性。检测GBS在预防孕妇感染起到重要作用，目前，检测GBS的金标准是在孕妇孕35～37周时，结合阴道和直肠标本，通过选择性增菌液培养方式诊断GBS。为更好地了解本地区孕35～37周妇女阴道GBS携带情况及不同方法的检出能力，为临床预防和治疗新生儿GBS感染提供理论依据，持续采集北京大学深圳医院孕35～37周妇女阴道分泌物采取GBS分离培养鉴定，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 持续采集2016年1—12月北京大学深圳医院产检门诊孕35～37周的1018例孕妇阴道分泌物拭子。采集的阴道分泌物拭子首先接种于B族链球菌选择性增菌肉汤中，35 ℃恒温培养16 h后转种于哥伦比亚血琼脂平板上，35 ℃恒温培养过夜。

1.2 方法 选取中等大小、灰白色、周围有或无β溶血环的可疑菌落，显微镜检查提示为阳性球菌，呈短链状排列，触酶试验阴性。所有菌株采用细菌生化鉴定仪（Vitek 2）（bioMérieux Industry，法国）和质谱仪（北京毅新博创生物科技有限公司）进行鉴定，显色平板（郑州安图生物工程股份有限公司）进行显色。

1.2.1 质谱仪 飞行时间质谱仪由主机、应用软件、仪器控制和计算机控制系统组成。因为不同质量离子拥有不同飞行速度，达到检测器时间也就不同，离子飞行时间遵循下列方程：m/z=Kt 2（K为常数）。借此将不同质量的离子分开。不同质量的离子会显示在质谱图上，根据质谱图峰值能分析出不同的分子，来判断为何种微生物。

操作步骤及结果判读：

1.3.2 Vitek 2 采用数码鉴定原理，每3个反应为1组，组内各项反应阳性时分别赋值1、2、4，然后计算每组数值,将各组反应结果相加。在电脑控制下，读数器每隔15 min对每个试卡读数1次，对各反应孔底物进行光扫描，动态观察反应情况。依据各孔反应数据作为判断根据，并组成生物数码，最后与菌种资料库中的标准菌生物模型相对照，获得系统鉴定值。操作步骤及结果判读：①选择鉴定试卡：革兰阳性球菌鉴定卡。②配置菌悬液：挑取菌落每管加入3 ml 0.45% NaCl溶液配置成0.5～0.63麦氏单位菌悬液。③在卡架上放入鉴定卡。将卡架放入填充仓；点击仪器上填充选项，对卡片进行填充；填充完毕后转装载仓，装载仓对卡片扫描完毕后，输入卡片编号，并保存。④检测完成后，查看电脑鉴定结果。

1.3.3 GBS增菌液 蛋白胨与葡萄糖为细菌生长提供能源；结晶紫可抑制某些革兰阳性菌生长而对链球菌无作用；叠氮钠和亚硫酸钠对革兰阴性细菌有抑制作用，对革兰阳性细菌则无作用。检验方法：①将培养基复温至常温25 ℃；②将采取的标本，以无菌操作方法接种入试管中，摇匀；③置35 ℃培养箱内培养24～48 h；④无细菌生长表现的培养基，需连续观察7 d，仍无细菌生长方可弃去。

1.3.4 显色平板 是以人工的方法配制而成的，除基础培养基外还添加了特异性酶底物，经GBS酶解作用释放出显色原从而使细菌呈现不同颜色，以此对GBS进行培养、分离、鉴定。检验方法：以无菌方法取样本直接划线接种于平板中，或无菌吸取0.1 ml适当浓度的样本溶液用玻璃涂布棒均匀涂布于平板中，置35℃～37 ℃温箱中培养，18～24 h后观察结果，个别菌株需要延长至24 h才能达到更好的效果。

表1 阳性判断标准

1.4 质量控制 金黄色葡萄球菌ATCC 29213，大肠杆菌ATCC 25922，粪肠球菌ATCC 29212（购自卫生部临检中心）进行质量控制。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

共收集1018例孕35～37周妇女阴道分泌物拭子，分离得到112株GBS。3种鉴定方法的检出率及正确率见表2。

表2 3种鉴定方法GBS检测结果比较

3 讨论

GBS感染是围产期并发症发生的重要原因。本研究中GBS分离培养阳性率为11.0%；欧美国家孕妇泌尿生殖道标本GBS分离率为4%～36%，大部分在20%以上[4]；与中国分离率大致相当，但因标本采集部位、分离鉴定方法等不尽相同，分离率存在一定差异[5]。

先进的GBS检测技术是诊断的重要部分，增菌是提高阳性率的第一步。GBS鉴定方法包括数码鉴定、比色生化（Vitek）、鉴别培养基、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）、荧光标记原位杂交技术（PCR）、荧光标记原位杂交技术（FISH）、环介导等温扩增技术（LAMP）等。分离培养方法是进行快速筛查的基础，但GBS的鉴定筛查试验要求简单，经济，耗时少，常规培养方法耗时长，适用范围窄。快速筛查方法的核心通常均是利用GBS较为特异的生物学性状，如产生溶血素、色素和特殊基因等重要特征，如免疫检测方法乳胶凝集法（LPA），对于GBS菌量较多孕晚期妇女，筛查效果较好，但需要注意菌量较少的患者可能漏检。现在有许多新的生化和基因方法，PCR和FISH的发展为细菌鉴定提供新的平台。对于来自临床的标本，GBS特异性PCR运用很多新技术来提高敏感性和特异性。这些方法的使用对于预防GBS和合理使用抗生素起到积极作用。

张秋菊等[6]曾报道比较普通培养法、先增菌再培养法和显色平板法阳性率分别为8.1%、9.2%、9.4%，差异无统计学意义。结果表明显色平板法检测GBS具有较高灵敏度和特异性，可以直接接种标本，操作简便，阳性率不低于先增菌再培养法，适合各级医疗机构用于围产期GBS筛查。张树琛和王杉[7]也曾报道评价过GBS显色平板的性能，结果也表明对GBS有很好的检出率。朱佩武等[8]也对GBS显色平板应用做过效果评价，发现除停乳链球菌似马亚种、GBS和少部分溶血葡萄球菌会在此显色平板上显紫色外，其余皆不显紫色，而这3种细菌在血平板上根据细菌形态不同较好区分。均与本研究结果符合，虽然检出率不尽相同，但是显色培养基作为医院实验室检测方法还是可靠的。本研究质谱仪检测GBS结果与Vitek 2完全一致，但是操作较为繁琐，过程中影响因素很多，人为造成的失误会影响最后的质谱图导致结果不符合，但是正确操作检出GBS准确率较高。

根据实验结果，显色培养基和飞行时间质谱仪均适用于检测GBS。其中显色培养基成本较低，操作简单，而且结果观察方便，但是需要隔天才能观察结果，培养周期较长，而且会有其他菌落的污染。飞行时间质谱仪操作稍微繁琐，但是耗时短，2 h即可出结果，检测结果准确率高，但是成本较高。各级医疗机构可结合自身情况选择不同检测方法。

随着围产期抗生素预防策略的广泛实施，GBS问题日趋严重，提高检出水平，为有效防治新生儿GBS感染，保护产妇及其胎儿健康提出更合理的预防措施及更有效的解决方案。

[1] 饶洁,胡凯.女性生殖道无乳链球菌带菌状况及药敏结果分析[J].实验与检验医学,2011,29(2):194-195.

[2] 黄荣,刘小平,樊尚荣,等.孕35～37周妇女无乳链球菌携带状况及耐药性分析[J].中国妇产科临床杂志,2015,16(3):269-270.

[3] Ke D,Bergeron MG.Molecular methods for rapid detection of group B streptococci[J].Expert Rev Mol Diagn,2001,1(2):175-181.

[4] 江敏,汪伟山.孕妇B族溶血性链球菌带菌状况与母婴预后的研究[J].中华全科医学,2012,10(4):506-507.

[5] Edwards MS,Baker CJ.Group B streptococcal infections in elderly adults[J].Clin Infect Dis,2005,41(6):839-847.

[6] 张秋菊,王利英,刘志磊.3种不同方法检测围产期B群链球菌感染的临床应用对比[J].中国卫生检验杂志,2016,26(9):1258-1262.

[7] 张树琛,王杉.一种新型B群链球菌显色培养基的应用及效果评定[J].首都医科大学学报,2016,37(5):681-683.

[8] 朱佩武,张雪青,吴庆.一种新型B群链球菌显色培养基的应用及效果评定[J].中国卫生杂志,2016,26(11):1594-1596.

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.06.042

北京大学深圳医院，广东深圳 518036

闫津津（1980.2-），硕士学位，主管技师。研究方向：临床检验