甘肃甘南野生羊肚菌液体发酵生长动力学研究

王龙，秦鹏，郭瑞，赵玉卉，王洁，路等学

（甘肃省科学院生物研究所，甘肃兰州730000）

甘肃甘南野生羊肚菌液体发酵生长动力学研究

王龙，秦鹏，郭瑞，赵玉卉，王洁，路等学

（甘肃省科学院生物研究所，甘肃兰州730000）

以甘肃甘南地区野生羊肚菌（Morchella esculenta）为研究对象，运用遗传算法进行了羊肚菌M.esculenta液体菌种发酵动力学参数估计，通过对不同初始串集的多次实验，各动力学参数估计收敛值结果基本一致。此外，运用Monod模型、Logistic模型以及1stOpt（FirstOptimization）软件对羊肚菌M.esculenta生长过程进行了拟合，通过对方程模拟结果的误差分析、相关性分析、中位数检验以及数据分布检验最终选择Logistic模型和1stOpt拟合模型作为此次实验羊肚菌M.esculenta液体菌种深层发酵生长动力学模型。

羊肚菌；液体发酵；生长动力学

羊肚菌（Morchella esculentaspp.）俗称羊雀菌、羊肚菜或草笠竹，隶属于子囊菌亚门（Ascomycotina），盘菌纲（Discomycetes），盘菌目（Pezizales），羊肚菌科（Morchellacea），羊肚菌属（Morchella），因其菌盖表面具有棱脊型的网状体，外观极似羊肚而得名[1-2]。羊肚菌富含各类氨基酸和维生素，又因其肉质脆嫩，风味独特，自古以来一直被奉为宴席上的美味佳肴，在国内外是食（药）用真菌中的珍品之一。中医认为其具有理气化痰、壮阳补肾、提神醒脑的功效；而西医认为此菌可降血脂，调节免疫功能，具有抗疲劳、抗辐射和抗肿瘤的作用[3-4]。自1897年BOUDIER首次建立羊肚菌属以来，菌物学家们在羊肚菌的分类、分布、生态、菌种保育及栽培技术等方面做了大量的研究工作[5-8]。目前，由于尚未解决羊肚菌人工栽培工业化生产的问题，液体菌种深层发酵在一定程度上解决了羊肚菌资源缺乏的现状。当前，羊肚菌的研究多集中于液体菌种深层发酵生产菌丝体和多糖为目的，但对其发酵动力学研究较为少见[9]。本实验主要以羊肚菌液体菌种为研究对象，利用遗传算法进行参数估计，预测其菌丝体生长的宏观状态随时间的变化情况，为发酵过程优化控制及发酵规模的进一步扩大奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试菌株采自甘肃甘南地区的迭部县境内，并经上海基康生物技术有限公司测序后，通过Genbank比对，最终确定为羊肚菌（Morchella esculenta）。参照周丽伟[10]筛选出的羊肚菌M.esculenta最佳液体发酵培养基为本实验所用，其配方为麸皮5%，蔗糖4%，KH2PO40.15%，MgSO40.15%，酵母膏0.5%，初始pH6.0，接种量为2%。

1.2 仪器与设备

BSD-WX（F）3350卧式摇床：上海博迅实业有限公司；SZK-750紫外可见分光光度计：深圳欧克仪表科技有限公司；DHG-9070A型立式鼓风干燥箱：上海捷呈实验仪器有限公司；JA2603B电子精密天平：上海精科天美贸易有限公司；TDL-60B低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 菌丝培养方法

将羊肚菌M.esculenta斜面菌株在无菌环境下直接接入三角瓶液体发酵培养基中，装液量为200 mL/500 mL，培养温度23℃，摇床转速160 r/min条件下振荡培养120 h。

1.3.2 菌丝生物量测定

参照王莹等[11]的取样方法，每隔12 h取发酵液一次（20 mL），3 000 r/min离心15 min；沉淀菌丝用无菌水冲洗2～3次，置于鼓风干燥箱，50℃烘干至质量恒定；然后用分析天平称质量，计算菌丝体生物量，生物量的测定公式见（1），实验设3个重复。

1.3.3 生长动力学模型

微生物液体菌种的生长随发酵时间的进行，其菌丝体生物量呈现非线性的变化[12-13]。依据本实验菌丝体深层培养的具体情况对羊肚菌M.esculenta生长条件进行一定的假设：假设1，菌丝体的生长为均衡式生长，即菌丝体细胞内各种成分呈相同比例增加，描述生长的唯一变量是菌丝生物量；假设2，培养基组分中只有碳源是限制菌丝生长的因素，其他组分均为过量且不影响其生长；假设3，在一定的发酵时间内，菌丝体生长得率为一常数。

真菌生长动力学模型常用Monod模型和Logistic模型进行描述[14]。基于上述的假设，本实验运用以上两种模型对羊肚菌M.esculenta生长过程进行拟合；再运用综合优化分析软件1stOpt（first optimization）对羊肚菌M.esculenta生长过程进行非线性模型拟合。通过分析三个模型预测值误差，检验预测值与实验值得相关性，中位数及分布类型，最终确定适合本实验羊肚菌M.esculenta的生长动力学模型。

（1）Monod模型：Monod模型是从经验得出的，常称为形式动力学。Monod模型是目前应用最广泛、形式最简单的微生物生长动力学模型。Monod模型描述培养基组分中只有碳源作为唯一的限制性因素（其他营养组分均为过量且不影响菌丝体生长）前提下，液体发酵基质中碳源质量浓度和羊肚菌菌丝体生物量的关系，其形式见（2）。

式中：Cx为菌丝体生物量，g/L；t为发酵时间，h；umax为最大生长速率，h-1；Cs为发酵液中碳源质量浓度，g/L；Ks为饱和常数，g/L。

（2）Logistic模型：Logistic模型主要用途之一就是预测，在建立了logistic模型后，可以根据模型预测在不同的自变量情况下，发生某种情况的概率大小。本实验Logistic模型以描述菌丝体生长速率与营养物质之间非线性的经验模型，其形式见（3）。

式中：umax′为最大生长速率，h-1；Cxmax为最大菌丝生物量，g/L。

（3）1stOpt软件：1stOpt是目前唯一能以任何初始值而求得美国国家标准与技术研究院（National Institute of StandardsandTechnology，NIST）非线性回归测试题集最优解的软件包。在非线性回归，曲线拟合及非线性复杂工程模型参数估算求解等领域首屈一指，而1stOpt凭借其超强的寻优，容错能力，在＞90%情况下，从任一随机初始值开始，都能求得正确结果[15]。

1.3.4 遗传算法的参数估计

遗传算法（genetic algorithms，GA）是一种基于生物自然选择与遗传机理的随机搜索算法，以其高效、自适应及益于全局搜索的优势在很多领域中得到应用。它的搜索面广，寻优速度快，得到的结果能以较大概率接近全局最优解，对于解决发酵动力学参数估计问题具有不可比拟的优势[16]。

本实验利用Matlab 2010a对Monod和Logistic模型进行参数估计，根据该语言特点和GA算法的基本原理以及所研究体系的具体情况，制定相应的操作方案[17]。

（1）初始化种群：个体是由二进制串组成染色体的基因码，可以随机产生一定数目的个体组成初始种群，种群的大小决定遗传算法GA参数估计的质量。种群规模若过小，其所含的信息太少，不能发挥遗传算法GA的效力；若过大，计算量随之增加，收敛时间延长。本试验选用的群体个数为随机产生的60个个体，数据类型为双精度浮点型。

（2）参数范围：参考相关资料[18]，为了尽可能扩大参数的寻优范围，又避免盲目搜索及减少计算量，设定相关参数范围为umax，umax′∈[0.01，1]，Yx/s∈[0.1，1]，ks∈[50，200]，Cxmax∈[13，16]，m0∈[0.0001，0.1]。

（3）适应度：遗传算法GA依据个体与适应度的比较而确定，预测值的误差（d值）越小，其适应度就越大，说明存活和生殖机会越高，被选择到下一代的概率也就越大。本实验的适应度用实验值与模型预测值的离均差平方和的倒数表示，其形式见（4）。

若y为实验值，y′为预测值，则

（4）遗传代数、选择、交叉和变异：A、遗传代数为达到100为准；B、选择则依据适应度优秀的个体作为下一代，本实验采用轮盘赌选择法，适应度越高的个体在父代中被选中的概率越大；C、交叉则指父代的部分基因进行交叉而得到下一代新的个体的操作，交叉体现了信息交换的思想，是遗传算法GA获取新优良个体的最重要的手段。本实验采用单点交叉法，经试验发现交叉概率pc选择0.4时拟合程度较好；D、变异则指在群体中选中一个个体后，通过随机变化该个体的基因型而得到新的个体，经试验发现取单点变异概率pm为0.05时最适宜。

综合上述条件的建立，最后确定求解条件，其形式见（5）。

2 结果与分析

2.1 菌丝生物量测定

该实验羊肚菌M.esculenta菌丝体生物量的测定结果（表1）可以看出，在设定温度下，羊肚菌菌丝生物量与发酵时间有一定的正相关性，即发酵时间越长，菌丝产量越大。

表1 羊肚菌M.esculenta液体菌种菌丝体生物量的测定结果Table 1 Determination results of mycelium biomass ofM.esculenta liquid culture

2.2 模拟结果与误差分析

表2 实验值与Monod，Logistic和1stOpt拟合预测结果Table 2 Fitting predicting results of the experiment value,and predicting results of Monod,Logistic&1stOpt model

Monod模型和Logistic模型利用Matlab 2010a遗传算法GA进行参数估计，利用Matlab语言进行编程，设定交叉概率pc=0.4，变异概率pm=0.05，初始种群数为60，遗传代数为100代；利用1stOpt软件的全局搜索功能直接进行模型拟合。经上述操作后得到三个预测模型，预测值与实验值的进化过程和拟合结果汇总见表2所示。由表2可知，从进化过程中可以看出Logistic方程及1stOpt软件拟合进化速度比Monod方程快，菌丝产量较高；而且前两者测量误差值也较Monod方程误差值小。

1stOpt拟合的模型预测值误差为4.6185，分别小于Logistic模型的6.5922和Monod模型的9.720 3，说明这三种模型在数据拟合过程中，1stOpt软件的拟合程度最好，且误差最小；其次是Logistic模型，Monod模型拟合效果不太理想。

2.3 检验分析

2.3.1 相关性分析

相关性分析是指对两个或多个具备相关性的变量元素进行分析，从而衡量两个变量因素的相关密切程度。由表3可以看出，通过皮尔逊相关系数（pearson correlation）分析时发现，在N（number）=11，即多个变量共11个数据参加运算中，Monod模型、Logistic模型和1stOpt软件预测值与发酵时间、实验值之间的绝对值均＞0.978，说明检验的多个变量之间相关密切程度很强。并且相关显著性系数Sig.（2-tailed）=0.01，说明在99.99%的几率上，皮尔逊相关系数成立，呈极显著相关（P＜0.01）。

表3 Monod，Logistic和1stOpt相关性分析Table 3 Correlation analysis of Monod,Logistic&1stOpt

2.3.2 中位数检验

假设：（1）H0：各模型预测值与实验值的中位数在总体上相等；（2）H1：各模型预测值与实验值的中位数在总体上不相等。

表4 Mann-Whitney U非参数检验表Table 4 Non-parametric test of Mann-Whitney U

在实验值和预测值数据为小样本且数据分布未知时，则首先应对各模型预测值与实验值之间运用独立样本Mann-Whitney U方法进行中位数检验，由表4可知，在0.01和0.05显著性水平下，对于三种模型都不拒绝H0，认为3种模型的预测值和实验值的中位数在总体上无显著差异（P＞0.05）。

2.3.3 数据分布检验

假设：（1）H0：各模型预测值与实验值的分布类型在总体上相同；（2）H1：各模型预测值与实验值的分布类型在总体上不同。

运用独立样本K-S检验对预测值和实验值的分布进行分析，结果见表5。结果表明，在0.01和0.05显著性水平下，对于三种模型也都不拒绝H0，认为3种模型预测值和实验值的分布在总体上无显著性差异（P＞0.05）。

表5 K-S检验表Table 5 Inspection table of K-S

综上所述，1stOpt拟合模型和Logistic模型较Monod模型更能实际的反映本实验数据的真实情况，见图1。因此，最终采用1stOpt拟合模型和Logistic模型作为此次实验羊肚菌M.esculenta生物量及其生长趋势的预测模型，其形式分别见（6）和（7）。

图1 实验值,Logistic&1stOpt数据分布图Fig.1 Distribution diagram of experiment value,Logistic&1stOpt data

1stOpt拟合模型：

（t=12，24，……，120，t为正整数；Cx∈（1.231 3，13.767），Cx为实数）

Logistic模型：

（t=12，24，……，120，t为正整数；Cx∈（1.230 1，13.418 9），Cx为实数）

3 结论

鉴于羊肚菌M.esculenta的生理功效和医学价值，希望进一步了解羊肚菌在深层发酵情况下的生长规律。本实验运用遗传算法进行了羊肚菌M.esculenta液体菌种发酵动力学参数估计，整个过程充分体现了遗传算法的高效性，通过对不同初始串集的多次实验，各动力学参数估计收敛值与上述结果基本一致。可以认为，所得到的结果以较大的概率接近全局最优解。此外，本实验运用Monod模型、Logistic模型以及1stOpt软件对羊肚菌M.esculenta生长过程进行拟合，需求最优解。最终选择Logistic模型和1stOpt拟合模型作为此次实验羊肚菌M.esculenta深层发酵生长模型。

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Liqiud fermentation growth kinetics ofMorchella esculentafrom Gannan region in Gansu province

WANG Long,QIN Peng,GUO Rui,ZHAO Yuhui,WANG Jie,LU Dengxue
(Institute of Biology,Gansu Academy of Science,Lanzhou 730000,China)

Using wildMorchella esculentafrom Gannan region in Gansu as research object,the liquid fermentation kinetic parameters ofM.esculenta was estimated using genetic algorithm.Through several experiments on different initial string sets,the results of kinetic parameters estimated value was basically identical.In addition,the growth process ofM.esculentawas fitted by Monod model,Logistic model and 1stOpt software.Through the error analysis,correlation analysis,median analysis and data distribution analysis of the simulated results by the equation,finally,Logistic model and 1stpt software were fitting for the experiments of the liquid fermentation growth kinetics ofM.esculenta.

Morchella esculenta;liquid fermentation;growth kinetics

S646.9

0254-5071（2017）06-0099-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.020

2016-12-21

甘肃省科学院青年科技创新基金项目（2016QN-07）；甘肃省科学院青年科技创新基金项目（2013QN-05）

王龙（1981-），男，副研究员，博士，研究方向为菌类作物育种与栽培。

*通讯作者：王洁（1979-），女，助理研究员，本科，研究方向为生物信息学。