钙螯合胶原多肽与雌激素对去卵巢大鼠骨质改善作用的比较

高文伟，申勇涛，程稚玲，韩克光，霍乃蕊*

(1. 山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801； 2. 山西省农业科技信息中心，太原 030000)

研究报告

钙螯合胶原多肽与雌激素对去卵巢大鼠骨质改善作用的比较

高文伟1，申勇涛1，程稚玲2，韩克光1，霍乃蕊1*

(1. 山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801； 2. 山西省农业科技信息中心，太原 030000)

目的 将钙螯合胶原多肽(CPCC)的骨质改善效果与雌激素进行比较，为安全的骨质疏松(osteoporosis，OP)防治药物的研发奠定基础。方法 切除大鼠双侧卵巢，设置切卵巢组(OVX)、假手术组(sham)、17β-雌二醇(OVX+E2)注射组与CPCC灌胃组(OVX+CPCC)，9周后比较各组的骨骼指标和血液生化指标。结果 OVX组股骨密度显著低于sham组(P<0.01)，说明OP发生。和激素一样，CPCC可有效抑制所测指标的异常变化，并使其维持在sham组水平(P>0.05)。然而在抑制体重增加方面，E2组在第8、9周体重显著低于sham组(P<0.01)；在阻止骨矿和骨有机质流失方面，E2组的Mg、Ca水平显著低于CPCC的中、高剂量组，Cu水平与sham组无差异，而CPCC(中、低剂量)则显著高于sham组。E2组的Mn、Zn、及羟脯氨酸水平显著低于sham组，而CPCC则可维持在sham组水平。对血液中BGP和StrACP水平升高的抑制作用，E2组与OVX组相比差异无显著性，CPCC组则可显著低于OVX组。抑制血钙水平下降时，E2组与OVX组相比差异无显著性，而 CPCC组显著高于OVX组。结论 在改善去卵巢大鼠骨质方面，钙螯合胶原多肽比雌激素更为有效。

钙螯合胶原多肽；17β-雌二醇；去卵巢大鼠；骨质疏松

骨质疏松(osteoporosis, OP)逐渐成为一个世界性公众健康问题[1]。我国的OP发病率逐年增加，其中80%患者为绝经后女性。研究绝经后OP最常用的造模方法是双侧卵巢去势法，该法可较好地模拟绝经后OP 的病理生理状态，造模成功率高、具有稳定性和重复性[2]。人们利用去卵巢大鼠模型筛选出了许多治疗绝经后OP的有效药物，包括雌激素、雌激素受体调节剂、双磷酸盐、降钙素、合成类固醇[3]。其中，雌激素替代疗法临床上最常用，但雌激素增加了患子宫内膜癌的风险，并容易引起中风和脑血栓，其使用风险远远高于人们所预想[4]。因此安全、有效、无毒副作用、可长期使用的OP防治药物的开发具有尤为迫切的现实意义。骨质疏松的发生与低钙摄入有关[5]，而钙质缺乏是全球性问题，从膳食结构分析，我国尤为严重[6]，肽钙螯合物可直接被肠道黏膜吸收，不会被胃酸和碱性物质破坏，也不会受到食物中植酸、草酸的影响，其生物利用度高、吸收快，是钙制剂发展和研究的方向。课题组前期研究结果证明了骨胶原肽和钙螯合胶原多肽对雌激素缺乏引起的OP的有效防治作用[7-8]。

本研究以分子量小于1000的胶原肽制备钙螯合胶原多肽(collagen peptide chelated calcium, CPCC)，探讨其对骨质疏松大鼠的骨质改善作用，并将其效果同雌激素比较，为以后安全、高效的补钙制剂和骨质疏松防治药物的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选用10周龄雌性清洁级雌性未孕SD大鼠48只，体重(203±20)g，由山西医科大学动物实验中心【SCXK(晋) 2015-0001】提供，适应性饲喂2周后，切除双侧卵巢。大鼠饲养于山西农业大学动物医学国家级实验教学示范中心动物房内，无菌手术在该中心动物医院【晋太谷动诊证[2014]第01号】完成，术后伤口用碘伏每日消毒一次，康复1周后，分组试验。研究期内保持大鼠环境温度为(22±2)℃，日照12 h，黑夜12 h，控制其他环境条件使其符合国家标准GB14923-2001，饲喂啮齿类动物标准颗粒饲料(山西医科大学动物实验中心提供)和自由饮水，并按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

研究分为6组，每组8只。假手术组(sham)不切除卵巢，只切除卵巢附近等重量的脂肪；模型组(OVX)切除卵巢；雌激素组(E2)切除卵巢后皮下注射17β-雌二醇(0.08 mg/mL)，注射剂量为1 mL/(0.1 kg·d)；CPCC组切除卵巢后按10 mL/(kg·d)的剂量进行灌胃，先用蒸馏水将CPCC配成500、300、100 mg/mL的溶液，分别灌胃给高、中、低剂量组。饲养结束后，用乙醚麻醉大鼠，摘除眼球采血，脱颈处死，采集各组织样本。本实验所有操作均按照中华人民共和国《实验动物管理条例》规范执行。

1.2 主要试剂与仪器

血清钙、血清磷、碱性磷酸酶(AKP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)、骨钙素(BGP)、羟脯氨酸测试盒购自南京建成生物工程研究所；17β-雌二醇购自北京索莱宝科技有限公司。

原子吸收光谱仪(北京东西分析仪器有限公司)；多功能酶标仪(美国Molecular Devices)；SX-12-10 型箱式电阻炉(上海实验电炉厂)等。

1.3 肽钙螯合物的制备

羊骨胶原肽由内蒙古锡盟肽好生物制品有限责任公司生产；以干基计，蛋白98.78%，分子量≤1000 Da的肽占90.78%，羟脯氨酸6.89%。螯合工艺为胶原短肽浓度89.28 mg/mL，钙源为CaCl2，肽钙质量比2∶1，pH 8.1，40℃反应30 min，加入8倍体积乙醇进行沉淀(乙醇质量分数>95%，静置3 h)，8000 r/min离心10 min，沉淀再经真空冷冻干燥(-26℃预冻，工作压强90～100 Pa，升华温度45～55℃)制得钙螯合胶原多肽(CPCC)，经测定其中短肽含量为68.16%，钙含量为10.01%，水分6.44%。

1.4 指标测定

1.4.1 体重和子宫指数

每周定期对大鼠进行称重一次，直至第9周实验结束。大鼠处死后，取子宫，去除周围结缔组织并立即称重，计算子宫指数。

1.4.2 股骨长度、直径、骨干重和骨密度的测定

用游标卡尺测量左侧股骨的长度与直径；然后在60℃烘箱中烘干至恒重(10 h)，测骨干重。按M/V计算骨密度，体积用排水法测定。

1.4.3 骨矿物质和羟脯氨酸含量的测定

准确称取风干至恒重的粉末状大鼠股骨于瓷坩埚中，放入马弗炉300℃预灰化1 h，温度调至550℃灰化3 h，关掉电阻炉，待温度降至110℃以下，取出坩埚，样品灰白色即可，若有黑色，则加1～2滴硝酸继续消化1 h，直至出现白色结晶。将灰分用2 mL盐酸(1∶5)溶解，在坩埚中再加入18 mL去离子水，混匀，测定铜、锰、锌含量。从处理好的铜待测液中取4 mL，用去离子水定容至50 mL，测定镁含量。取定容好的镁待测液10 mL，加5%氯化锶溶液0.2 mL，然后用原子吸收光谱仪进行钙含量的测定。羟脯氨酸含量的测定按照羟脯氨酸测试盒说明书操作。

1.4.4 血液生化指标

大鼠宰杀前，断食12 h，眼球取血，收集血样进行离心(3000 r/min，10 min)，分装血清，置-20℃保存。血清碱性磷酸酶(AKP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)活性、血清骨钙素(BGP)、血清钙(Ca)、血清磷(P)含量的测定按剂盒说明书操作。

1.4.5 统计方法

2 结果

2.1 大鼠体重的变化

由表1可知，在前2周，各组大鼠体重差异无显著性，从第3周开始，OVX组体重显著高于sham组，且从第6周开始达到极显著水平(P<0.01)。整个试验期内，除低剂量组在第4周外，各剂量组的体重始终与sham组差异无显著性(P>0.05)。而E2组，在第3周极显著高于sham组，在第8、9周却又极显著低于sham组。

表1 17β-雌二醇和钙螯合胶原多肽对去卵巢大鼠体重增加的抑制作用Tab.1 Inhibition role of 17β-estradiol and collagen peptide chelated calcium on the body weight gain of ovariectomized rats

注：大写字母ABCD表示列内数据在P<0.05 水平处比较；小写字母abcd表示在P<0.01 水平处比较。标有相同字母表示差异无显著性，不同字母表示差异有显著性。下表和下图同。

Note. Uppercase letters A B C D and lowercase letters a b c d represent significant differences atP<0.05 andP<0.01 levels, respectively. The same letter means non-significant and different letter means significant difference. The following tables and figures are the same.

2.2 左侧股骨物理指标的测定

由表2可知，卵巢摘除对大鼠股骨的长度、直径和湿重没有显著影响，但低剂量组的长度和雌激素组的直径显著低于其他各组(P<0.05)。卵巢摘除可引起干重和骨密度极显著降低(P<0.01)。各剂量组均未使干重回复到假手术组水平。中、高剂量组和E2组的骨密度差异无显著性，均显著高于OVX组，且与Sham组差异无显著性。

2.3 骨矿物质含量

由表3可知，与sham组相比，OVX组股骨中的Cu、Mn、Zn、Mg水平均显著下降。E2组可使Cu水平上升至sham组水平， 而中、低剂量组则显著高于sham组。E2组的Mn虽有升高，但仍显著低于sham组，而中、低剂量组则上升至sham组水平。除E2组外，各剂量组Zn水平均回复至sham组水平。E2组的Mg水平虽然也恢复至正常水平，但其数值显著低于中、高剂量组。 对于Ca，OVX组含量最低，E2组的Ca水平虽有上升，但显著低于中、高剂量组，中剂量组甚至显著高于假手术组(P<0.05)。 所以整体上讲，卵巢摘除可引起大鼠股骨中的骨矿物质流失，雌激素和钙螯合胶原多肽可阻止这种流失，钙螯合胶原多肽效果优于雌激素。

表2 各组大鼠左侧股骨各种物理指标的测定结果Tab.2 Determination results of various physical indexes of the left femurs of rats in each group

表3 各组大鼠股骨中的矿物元素含量比较Tab.3 Mineral content of the femurs of rats in each group

2.4 骨羟脯氨酸含量

经测定和统计学分析，sham组(2.258±0.22Aa)与OVX组(1.922±0.12Cb)大鼠股骨中的羟脯氨酸含量差异有显著性(P<0.01)，E2组(2.061±0.090BCab)虽有所提高，但仍与OVX组差异无显著性，而CPCC的高(2.092±0.094B)、中(2.110±0.12AB)、低(2.095±0.18)各剂量组均显著高于OVX组，且中剂量组与sham组差异无显著性。可见在防止骨质有机质流失方面，钙螯合胶原多肽效果优于雌激素。

2.5 子宫的重量及形态变化

雌激素的水平和变化对于子宫的形态和功能起着至关重要的作用。人体内，子宫随雌激素水平的增高而保持饱满，随雌激素水平的下降，子宫开始萎缩，甚至可缩小到拇指般大，因而子宫的形态和功能也可以反映体内雌激素的水平。

图1 卵巢摘除后雌激素和钙螯合胶原多肽对子宫系数的影响Fig.1 Effect of estrogen and collagen peptide chelated calcium on the uterine coefficient of ovariectomized rats

由图1可以看出，切卵巢组的子宫系数极显著低于假手术组(P<0.01)，和雌激素一样，CPCC的各剂量组均可使子宫系数恢复到正常水平，表明CPCC对大鼠有雌激素样作用。在形态上(图2)，sham组大鼠的子宫形态饱满，子宫角粗大且颜色红润；切卵巢组大鼠子宫明显萎缩、色泽泛白；17β-雌二醇组子宫异常膨大，颜色泛黄，内有黄色粘液。而CPCC组子宫颜色比假手术组红润，形态饱满。

2.6 血碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶、骨钙素活力的测定

血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)是由成骨细胞合成并释放的评价骨形成和骨转换的一个重要骨代谢指标[9]。高骨转换率的骨质疏松时，AKP由肝和骨释入血清，使其含量增高。

血中的抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)主要来源于破骨细胞。切卵巢以后，内源性雌激素分泌减少，骨吸收大于骨形成，血清 StrACP 显著增高，所以StrACP可作为原发性骨质疏松症的诊断治疗监测指标[10]。

骨钙素(bone gamma-carboxyglutamic-acid-containing proteins, BGP)是由成骨细胞分泌的一种活性多肽，在调节骨钙代谢中起着重要作用，其较AKP更灵敏，特异性更高，所以BGP可作为新的检测指标。

制作骨钙素标准曲线(图略)，求得A450(Y)与骨钙素浓度(X)之间的回归方程为Y=0.014X + 0.11574(R2=0.9902)，将测得的A值代入方程式，计算各组的骨钙素浓度。

注：a. 模型组; b.假手术组；c.雌激素组；d.高剂量CPCC组；e.中剂量CPCC；f.低剂量CPCC组。图2 各组大鼠子宫形态Note. a. OVX; b. sham; c. E2; d. High dose CPCC; e. Moderate dose CPCC; f. low dose CPCC.Fig.2 Gross appearance of the uterine of rats in each group

组别GroupsAKP金氏单位U/100mLStrACPU/LBGPpg/mLSHAM18.38±1.93Bb40.08±4.11Bb156.57±7.40BabOVX23.71±0.57Aa49.17±3.55Aa168.53±1.54AaE218.54±2.74Bb40.25±6.9ABab159.63±4.76ABab高剂量组Highdose18.45±0.88Bb35.81±5.83Bab151.46±7.63Bb中剂量组Moderatedose18.11±1.57Bb32.07±3.21Bb149.76±9.69Bb低剂量组Lowdose18.86±0.89Bb33.3±0.54Bb158.27±2.73ABab

与假手术组相比，切卵巢组大鼠AKP(P<0.01)、BGP(P<0.05)以及StrACP水平均显著升高。说明雌激素缺乏，骨质疏松发生时，骨转换加快，破骨作用增强，引起代成骨细胞代偿性分化，即骨形成与骨吸收功能均增强，骨代谢处于高转换状态[9]。而雌激素组和钙螯合胶原多肽组均可使其降低至与假手术组无显著差异的水平。但雌激素组的BGP和StrACP水平仍与切卵巢组差异无显著性，而各剂量组的StrACP水平，中高剂量组的BGP水平则显著或极显著低于OVX组。

2.7 血清中钙、磷含量的测定

与骨矿化有关的生化指标主要为血钙和血磷。钙是生物体内含量最多的离子，磷含量仅次于钙，其中约70%～80%沉积于骨骼[11]。

组别GroupsCammol/LPmmol/L钙磷比Ca/PratioSHAM2.593±0.093Aab3.107±0.13AB0.8346BCbcOVX2.504±0.025Bb2.994±0.090AB0.8363BCabcE22.547±0.048ABab2.991±0.032B0.8516ABab高剂量组Highdosegroup2.614±0.018Aab3.048±0.13AB0.8576Aab中剂量组Moderatedosegroup2.622±0.0084Aa3.159±0.060A0.8300Cc低剂量组Lowdosegroup2.620±0.011aAa3.054±0.027AB0.8579Aa

由表5可知，切除卵巢可显著降低血钙水平(P<0.05)，E2组和CPCC组均可使其回升到假手术组水平，但E2组仍与OVX组差异无显著性，而各剂量组的血钙水平则显著高于OVX组。

除中剂量组的血磷水平显著高于雌激素组外，其余各组大鼠的血磷水平差异无显著性，但切除卵巢也使血液中的血磷水平有所下降，各剂量组在数值上均比雌激素组高。

钙磷的比值在0.831～ 0.875之间，属于正常范围，说明CPCC不会影响血液中的钙磷平衡[12]。可见切除卵巢主要影响血钙水平，而对血磷和钙磷比无显著影响。

3 讨论

骨质疏松症是一种复杂的，由营养、环境、生活方式、遗传、免疫、激素调控等多种因素引起的以骨量减少，骨微观结构退化，脆性增加以及易于发生骨折为特征的一种非特异性骨代谢障碍疾病[12，13]。在中年期，骨吸收大于骨形成，骨量持续丢失，妇女在绝经后的5～15年由于雌激素分泌停止，骨量减少尤为突出[12]。包括美国在内的许多国家，骨质疏松已达到了流行的比例[14]。雌激素替代疗法可有效防治绝经后骨质疏松，但其副作用日益受到人们的关注。

与假手术组相比，切除卵巢后大鼠的股骨密度极显著降低，说明骨质疏松造模成功。除骨密度降低外，骨质疏松发生时，大鼠的体重显著增加，韩天雨等[9]的研究结果也表明去除卵巢3周后，OVX组的体重便显著增加，但达到极显著水平在第12周，本研究则在第6周。 骨质疏松发生时，去卵巢大鼠的子宫发生严重萎缩，该结果与戴哲浩等[15]的研究结果一致。本研究测定结果还表明骨质疏松引起大鼠股骨中的Cu、Mn、Zn、Ca、Mg等骨矿物质流失，且反应胶原含量的羟脯氨酸的含量也显著下降；血Ca也水平显著下降，血液中的AKP、BGP、以及StrACP水平均显著升高。 刘昊等[16]的研究在证实雌性大鼠卵巢切除后20 周发生明显的骨量丢失、微观结构退变和生物力学性能下降。韩天雨[9]、于志锋[17]等对去卵巢大鼠的血清ALP水平进行动态监测的研究结果表明，ALP水平的升高发生在骨质疏松的前期，24周下降至最低水平，此后便保持水平恒定。以上研究提示在骨质疏松发生的前期，骨转换加快，破骨分化加剧，代偿性地引起成骨分化加剧，骨骼中的ALP 释放到血液导致血清ALP 显著上升，在骨质疏松发生的后期，ALP较前期又显著下降，说明大鼠骨骼的成骨分化减弱，已产生大规模的骨量丢失，骨质疏松症完全形成[17]。本研究指标测定时切除卵巢后10周，说明尽管骨质疏松发生了，ALP水平仍很高，但仍然处于前期阶段。

大鼠切除双侧卵巢后，注射17β-雌二醇或灌胃所制备的钙螯合胶原多肽，结果表明钙螯合胶原多肽具有雌激素样作用，实验结束时使上述各指标与假手术组相比差异无显著性，即和雌激素具有一样的效果，可抑制体重增加和子宫萎缩，可扭转上述其他各种指标的升高或降低。

与雌激素组相比，钙螯合胶原多肽对骨质疏松的防治效果更好。在抑制体重增加方面，钙螯合胶原多肽与假手术组在整个实验期间差异无显著性，而雌激素组在第8周和第9周体重极显著低于Sham组。雌激素组的股骨直径显著低于其他各组。在阻止骨矿物质流失方面，雌激素组可使Cu水平上升至假手术组水平， 而螯合物的中、低剂量组则显著高于假手术组。雌激素组的Mn、Zn水平仍显著低于假手术组，而螯合物则可使其上升至假手术组水平。雌激素组的Mg、Ca水平虽然也恢复至正常水平，但其数值显著低于中、高剂量组。雌激素组的股骨中的羟脯氨酸含量仍未回到正常水平，而钙螯合胶原多肽的中剂量组则可。雌激素组外周血中的BGP和StrACP水平仍与切卵巢组差异无显著性，而各剂量组的StrACP水平，中高剂量组的BGP水平则显著或极显著低于OVX组。

雌激素还可引起子宫的极度膨大，内部黏液增加， 颜色灰变等病理变化，郭盖等[18]的研究结果也表明雌激素具有使OVX大鼠子宫重量和子宫直径显著增加的副作用，所以综上所述，钙螯合胶原多肽比雌激素更有效，更安全。

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Comparison of the ameliorating effect of collagen peptide chelated calcium and estrogen on the bone quality in ovariectomized rats

GAO Wen-wei1, SHEN Yong-tao1, CHENG Zhi-ling2, HAN Ke-guang1, HUO Nai-rui1*

(1. College of Animal Science And Veterinary Medicine, Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China； 2. Shanxi Agricultural Technology Information Center,Taiyuan 030000)

Objective To compare the ameliorating effect of collagen peptide chelated calcium (CPCC) and estrogen on the bone quality in ovariectomized rats in order to serve the development of safe drugs for prevention of osteoporosis (OP). Methods Bilateral ovariectomized rats were divided into ovariectomized group (OVX), sham group, 17β-estradiol injection group (OVX+E2) and CPCC gavage group (OVX+CCCP). Bone and serum indices of these groups were assessed and compared at 9 weeks after treatment. Results Bone density of the OVX group was significantly lower than the sham group (P<0.01), indicating that the rat OP model was successfully established. Like estrogen, CPCC inhibited the abnormal changes of all indices and maintain similar levels with those of the sham group (P>0.05), while the body weight gain of the E2group at weeks 8 and 9 was significantly lower than those of the sham group (P<0.01). As regarding the prevention of bone loss, the Mg and Ca levels of the E2group were significantly lower than those of the moderate and high dose CPCC groups. The Cu level was not significantly different compared with the sham group，while those in the moderate and low dose CPCC groups were significantly higher than the sham group. The Mn, Zn and hydroxyproline levels of the E2group were significantly lower than those of the sham group, while the CPCC group maintained levels similar to that of the sham group. In regarding to the inhibiting effect on the increased blood BGP and StrACP, the E2group was still maintained at levels similar to that of the OVX group, while those of the CPCC group were significantly lower than the OVX group. As regarding the decreased blood Ca, the E2group was not significantly different with that of the OVX group, while that of the CPCC group was significantly higher than the OVX group. Conclusions CPCC is more effective than estrogen in ameliorating the bone quality of ovariectomized rats.

Collagen peptide chelated calcium; 17β-estradiol; Osteoporosis; Ovariectomized rats

HUO Nai-rui. E-mail: tgnrhuo@163.com

国家自然科学基金(编号：31201347)；山西省回国留学人员项目(编号：2014-042)。

高文伟(1970—)，女，副教授，研究方向：动物疾病诊断与防治。Email: sxndgaowenwei@163.com

霍乃蕊(1972—)，女，教授，研究方向：兽医公共卫生与食品安全。Email: tgnrhuo@163.com

Q95-33

A

1005-4847(2017)03-0256-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.03.005

2016-10-13