CD36在氧化低密度脂蛋白降低鼠源细胞锰超氧化物歧化酶活性中的作用

王 钊

(邢台市人民医院普外科，河北 邢台 054000)

CD36在氧化低密度脂蛋白降低鼠源细胞锰超氧化物歧化酶活性中的作用

王 钊

(邢台市人民医院普外科，河北 邢台 054000)

目的 探讨CD36在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)降低大鼠锰(Mn)超氧化物歧化酶(SOD)活性中的作用。方法 将鼠源RAW264.7巨噬细胞按照处理方式分为ox-LDL处理组和抗CD36拮抗组；ox-LDL处理组在培养液中加入100 mg/L ox-LDL，抗CD36拮抗组在培养液中先加入2 mg/L抗CD36 mAb预处理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL。实验结束后比较两组细胞凋亡率和Mn-SOD活性。结果 ox-LDL处理组24、48 h的细胞凋亡率〔分别为(10.8±2.91)%与(29.88±4.47)%〕明显高于抗CD36拮抗组〔(5.83±1.18)%与(7.63±1.64)%〕(均P<0.05)。两组0 h时Mn-SOD活性无显著差异(P>0.05)；ox-LDL处理组24、48 h的Mn-SOD活性〔分别为(17.17±2.90)%与(16.73±2.87)%〕明显低于抗CD36拮抗组〔(29.34±4.72)%与(22.83±3.72)%〕(均P<0.05)。结论 CD36在ox-LDL所介导的脂质转运和代谢过程中具有重要作用。

CD36；氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)；锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)

研究表明低密度脂蛋白(LDL)氧化是动脉粥样硬化(AS)的重要特征，氧化(ox)-LDL是LDL经氧化修饰后形成的，此反应与体内的氧化应激有关〔1〕。作为一种脂蛋白氧化产物，在脑梗死的发生、发展过程中发挥重要作用。研究证明脂质丰富的斑块往往结合更多的ox-LDL抗体，因此ox-LDL的含量高低与斑块的不稳定性密切相关〔2，3〕。抗氧化酶类是体内最重要的对抗自由基氧化损伤的防御系统，其中超氧化物歧化酶(SOD)是体内对抗自由基的第一道防线，其广泛存在于自然界的动物、植物及一些微生物体内，能够清除生物体内的氧自由基，是最重要的抗氧化酶〔4，5〕。CD36是一种多功能的清道夫受体，可介导细胞ox-LDL的内吞和降解。本研究通过分析CD36在ox-LDL降低大鼠锰(Mn)-SOD活性中的所发挥的作用，以探讨LDL的降脂作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与实验分组 鼠源RAW264.7巨噬细胞购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的杜尔伯科改良伊格尔培养基(DMEM)培养于37℃、5%CO2的培养箱中。采用抗CD36单克隆抗体封闭受体(2.5 mg/L)，将细胞分为ox-LDL处理组和抗CD36拮抗组；ox-LDL处理组在培养液中加入100 mg/L ox-LDL，抗CD36拮抗组在培养液中先加入2 mg/L抗CD36 mAb预处理1 h，再加入100 mg/L ox-LDL。

1.2 主要试剂与仪器 DMEM(Hyclone)，ox-LDL(北京协生生物科技有限公司)，SOD及分型SOD检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，抗CD36单克隆抗体，AnnexinⅤ-FITC 试剂，流式细胞仪(Beckman Coutler Epics XL)，超声细胞破碎仪(Cole-Parmer CPX400)。

1.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 收集细胞，用0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化细胞，制备细胞悬液，离心弃上清液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，收集细胞，用Annexin V-FITC试剂盒中结合缓冲液悬浮细胞，调节浓度为1×106/ml，取100 μl按试剂盒说明上机检测。

1.4 黄嘌呤氧化酶法测定Mn-SOD的活性 用超声细胞破碎仪将细胞破碎，按照试剂盒说明检测总SOD和铜/锌(Cu/Zn)SOD的活性，Mn-SOD活性=总SOD活性-Cu/Zn SOD活性。

1.5 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1 两组细胞凋亡率比较 ox-LDL处理组24、48 h细胞凋亡率〔分别为(10.8±2.91)%与(29.88±4.47)%〕明显高于抗CD36拮抗组〔(5.83±1.18)%与(7.63±1.64)%〕(t=4.928,t=11.390；均P<0.001)。

2.2 两组Mn-SOD活性比较 两组0 h时Mn-SOD活性无显著差异(P>0.05)；抗CD36拮抗组处理24、48 h明显高于ox-LDL处理组(P<0.001)。见表1。

表1 两组处理后各时点Mn-SOD活性比较

3 讨 论

ox-LDL是造成内皮损伤的重要因素，可通过多种机制损伤内皮细胞，在AS等疾病的发生与发展中起着重要作用〔6〕。与ox-LDL的相关受体很多，其中CD36和凝集素样氧化型LDL受体(LOX)-1在近年来备受关注〔7，8〕。LOX-1是ox-LDL的特异性受体，与血管内皮细胞摄取和代谢ox-LDL密切相关；ox-LDL可导致CD36上调，引起内皮细胞损伤，促进AS斑块形成。SOD 是生物体内各个组织中唯一能够特异性清除氧自由基的抗氧化酶，能平衡生物体的氧自由基，使机体免受到氧自由基的危害。其中以线粒体中的Mn-SOD的作用最为重要，在体内活性氧系统和氧化还原有关的平衡体系中发挥着关键作用〔9〕。根据活性中心所含金属离子的不同，SOD主要可分为Mn-SOD、铁(Fe)-SOD及Cu/Zn-SOD。Mn-SOD存在于所有真核及原核生物的线粒体中，后者又是细胞产生能量和进行有氧代谢的重要场所，因此也是自由基产生的场所，故要防止自由基对线粒体的损伤，Mn-SOD作用具有重要地位〔10〕。CD36具有介导细胞黏附、细胞分化、细胞信号传递、参与长链脂肪酸的转运等作用。CD36是巨噬细胞表面主要识别、摄取ox-LD的B类清道夫受体，其结合和摄取的ox-LDL占到巨噬细胞结合和摄取修饰脂质总量的50%以上，且不受细胞内胆固醇含量的负反馈调节。研究发现，抑制CD36表达则可减缓AS进展；CD36缺乏患者的单核细胞与ox-LDL的最大结合率比正常人要低40%〔7〕。本研究提示预先用抗CD36的单克隆抗体封闭细胞，减少细胞对ox-LDL的吞噬作用，因此抑制ox-LDL所产生的细胞凋亡作用。Mn-SOD主要位于线粒体，多为诱导表达型。而线粒体在新陈代谢过程中产生的氧自由基及细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、干扰素(IFN)-γ等都会对Mn-SOD的表达产生诱导作用。当细胞被抗CD36的单克隆抗体封闭后，细胞相关的代谢与降解受到抑制，细胞内脂质过氧化反应的代谢终产物明显降低，Mn-SOD消耗减少，活性增高。而ox-LDL处理组由于脂质代谢产物的增加，细胞内的氧自由基堆积，消耗了大量的Mn-SOD，因此Mn-SOD活性下降。

综上，CD36在ox-LDL所介导的脂质转运和代谢过程中具有重要作用，在研究调血脂及防治动脉粥样硬化药物，防治心脑血管疾病中具有重要意义。

1 叶南慧，林艳云，刘树滔，等.口服PTD-SOD对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.中国现代应用药学，2011；28(7)：602-6.

2 Niizuma K，Yoshioka H，Chen H，etal.Mitochondrial and apoptotic neuronal death signaling pathways in cerebral ischemia〔J〕.Biochim Biophys Acta,2010；1802(1)：92-9.

3 苗 成，李金国，苗 芳，等.槲皮素对ox-LDL所致的小鼠巨噬细胞脂质蓄积和过氧化的影响〔J〕.中国病理生理杂志，2013；29(8)：1370-4.

4 Sakata H，Niizuma K，Wakai T，etal.Neural stem cells genetically modified to overexpress Cu/Zn-superoxide dismutase enhance amelioration of ischemic stroke in mice〔J〕.Stroke，2012；43(9)：2423-9.

5 赵 莉，姚树桐，陈 军，等.载脂蛋白A-I模拟肽D-4F对巨噬细胞源性泡沫细胞清道夫受体 A1 的抑制作用〔J〕.中国病理生理杂志，2014；30(10)：1742-7.

6 Fukui M，Zhu BT.Mitochondrial superoxide dismutase SOD2，but not cytosolic SOD1，plays a critical role in protection against glutamate-induced oxidase stress and cell death in HT22 neuronal cells〔J〕.Free Radic Biol Med，2010；48(6)：821-30.

7 姚树桐，桑 慧，杨娜娜，等.氧化低密度脂蛋白诱导巨噬细胞内质网应激及CD36的可能作用〔J〕.生理学报，2010；62(5)：433-40.

8 Liao X，Sluimer JC，Wang Y，etal.Macrophage autophagy plays a protective role in advanced atherosclerosis〔J〕.Cell Metab，2012；15(4)：545-53.

9 Velikkakath AK，Nishimura T，Oita E，etal.Mammalian Atg 2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets〔J〕.Mol Biol Cell，2012；23(5)：896-909.

10 Yao S，Miao C，Tian H，etal.Endoplasmic reticulum stress promotes macrophage-derived foam cell formation by up-regulating cluster of differentiation 36(CD36) expression〔J〕.J Biol Chem，2014；289(7)：4032-42.

〔2016-03-27修回〕

(编辑 苑云杰)

王 钊(1982-)，男，硕士，主治医师，主要从事普通外科疾病研究。

R363.2

A

1005-9202(2017)13-3190-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.029