骨关节炎患者软骨细胞Fas基因增强子区甲基化水平与Fas蛋白表达的相关性

陈 夏 彭 丹 陶 怀 沈 奕 周 政

(中南大学湘雅二医院骨科，湖南 长沙 410011)

骨关节炎患者软骨细胞Fas基因增强子区甲基化水平与Fas蛋白表达的相关性

陈 夏 彭 丹 陶 怀1，2沈 奕 周 政

(中南大学湘雅二医院骨科，湖南 长沙 410011)

目的 通过观察骨关节炎(OA)软骨细胞中Fas基因甲基化水平与Fas蛋白表达的相关性，探讨Fas基因增强子区异常甲基化在OA发生和发展中的作用。方法 采用亚硫酸氢钠方法处理基因组DNA，甲基化特异性PCR技术和免疫组织化学法分别检测14例健康人和35例OA患者软骨细胞中Fas基因增强子区甲基化水平和相关蛋白表达情况。结果 OA组Fas基因增强子区低甲基化率及软骨细胞Fas蛋白表达阳性率均明显高于健康对照组(P<0.01)，且Fas基因低甲基化及蛋白表达与性别，年龄无明显相关性(P>0.05)。Fas增强子低甲基化与Fas蛋白表达呈显著正相关(P<0.01)。结论 OA患者关节软骨细胞Fas基因增强子区呈低甲基化状态，通过上调Fas蛋白表达参与OA的发生发展。

骨关节炎;Fas增强子;甲基化

近年研究证实软骨细胞过度凋亡与骨关节炎(OA)发生发展密切相关〔1〕。在某些病理条件下，软骨细胞中一系列表达调控基因被激活，通过死亡受体途径介导凋亡的发生。Fas/FasL信号传导通路是介导细胞凋亡的重要死亡受体途径。已有研究表明，Fas/FasL通路介导的软骨细胞凋亡在关节软骨损伤机制中起着重要的作用，而Fas基因表达受甲基化调控〔2〕。Petak等〔3〕用甲基化特异性PCR检测了结肠癌患者癌组织细胞中的Fas基因增强子甲基化情况，发现Fas基因增强子甲基化降低了Fas蛋白的表达并且抑制了Fas介导的细胞凋亡，表明甲基化在Fas蛋白表达调控上发挥着重要的作用。 de Andrés等〔4〕也报道OA的发生发展过程与软骨细胞的DNA甲基化有一定相关性。 因此，DNA甲基化异常是影响细胞Fas表达及Fas介导OA中软骨细胞凋亡的一个重要机制。本文采用亚硫酸氢钠测序法检测关节软骨细胞中Fas基因增强子区甲基化情况，采用免疫组化法检测关节软骨细胞中Fas蛋白的表达情况，以探讨Fas基因增强子区甲基化异常在OA发生发展中的作用及其调控机制。

1 材料与方法

1.1 一般材料 14例正常膝关节软骨组织取自2012年9月至2014年7月因交通事故在中南大学湘雅二医院行大腿中下段截肢的患者，男8例，女6例；年龄30～62(平均40)岁。35例OA膝关节软骨组织取自2013年9月至2014年在中南大学湘雅二医院就诊，根据1995年美国风湿协会骨关节炎的诊断标准，诊断为OA且有关节置换手术指征的患者，男16例，女19例；年龄52～79(平均65)岁。术中无菌采集标本，每组标本分为2份∶1份放液氮内保存，进行DNA甲基化检测；另 1份石蜡包埋，进行免疫组化分析。

1.2 亚硫酸氢钠测序 软骨细胞DNA提取参照TIANGEN公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒具体说明进行操作：取软骨组织50 mg，经EDTA脱钙液脱钙后，加入组织裂解液进行匀浆，匀浆经蛋白酶K消化后，用吸附柱法提取软骨组织DNA,分光光度计检测DNA纯度和浓度，琼脂糖凝胶电泳法鉴定DNA完整性，4℃保存备用。取30 μl DNA 水溶液用EZ DNA甲基化试剂盒(北京天漠公司)进行纯化和DNA甲基化修饰,处理后的DNA储存在-70℃冰箱中保存。根据文献〔3〕报道的引物序列，由上海生工生物工程技术有限公司合成。Fas甲基化上游引物序列为5′-AGTTTCGGCGTTTTTCGGAGATTATTGC-3′，下游引物序列为5′-CACCCGCGCCGAAACGAACC-3′；Fas非甲基化上游引物序列为5′-GGTAGTTTTGGTGTTTTTTGGAGATTATTGT-3′,下游引物序列为5′-CACCCACACCAAAACAAACCTTTAAC-3′。PCR总反应体系20 μl,DNA模板2.0 μl，上游和下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，Taq酶10 μl，加ddH2O稀释至总体积20 μl。取5 μl扩增产物上样，以2 μl DNA Marker作为标准对照,2%琼脂糖凝胶电泳，恒电压(120 V)电泳25 min，溴乙啶染色，紫外灯下检测扩增产物，拍照保存图片后，含目的样品的PCR产物置于4℃保存备用。

1.3 免疫组织化学检测 石蜡包埋组织标本，5 μm连续切片。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶SP法检测，切片常规脱蜡处理后，置于抗原修复液中95℃修复10～15 min，其余步骤参照说明书进行。切片经梯度乙醇脱水、干燥、二甲苯透明，中性树胶封固后，在显微镜下观察并拍照。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行χ2检验或Fisher确切概率法检验和Spearman等级相关分析。

2 结 果

2.1 DNA完整性检测 提取的基因组DNA经2%琼脂糖凝胶电泳，DNA片段大于600 bp。DNA完整，无降解，见图1。

2.2 OA患者和健康人软骨细胞中Fas增强子区甲基化状态比较 以DNA Marker作为对照，其中OA组与健康对照组软骨细胞Fas基因增强子区低甲基化百分率分别为74.29%(26/35)和28.57%(4/14)，两组差异有统计学意义(χ2=8.803，P=0.003)，见图2。

1：DNA Marker;2～8：DNA样品1～7图1 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳条带

2.3 OA患者和健康人软骨细胞中Fas蛋白表达情况 Fas 蛋白表达阳性表现为胞质或核膜出现棕黄色染色，经分析，OA组与健康对照组软骨细胞Fas蛋白阳性率分别为77.14%(27/35)和14.29%(2/14)，两组间差异有统计学意义(χ2=16.356，P=0.002)，见图3。

1：DNA Marker;2:Fas增强子区甲基化引物扩增后的产物(184 bp)；3：Fas增强子区非甲基化引物扩增后的产物(187 bp)图2 两组Fas基因增强子区甲基化状态

图3 两组软骨细胞中Fas蛋白表达情况(DAB，×200)

2.4 Fas基因甲基化及蛋白表达与性别、年龄之间的关系 Fas基因低甲基化及Fas蛋白表达与性别、年龄无明显相关性(P>0.05)，见表1。

表1 所有研究对象Fas基因低甲基化及蛋白表达与性别、年龄的关系(n)

2.5 OA患者软骨细胞中Fas增强子区低甲基化状态与蛋白表达的关系 26例Fas增强子低甲基化的OA患者中，有24例蛋白表达阳性；而27例Fas蛋白表达阳性的OA患者中，有24例Fas增强子低甲基化，Fas增强子低甲基化与蛋白表达呈显著正相关(r=0.614,P<0.01)。

3 讨 论

OA是一种以关节软骨退行性病变和关节周围骨质增生为病理特征的慢性退行性疾病，其发病率随年龄增长逐渐增加。软骨细胞作为成熟软骨组织内唯一细胞类型，在软骨损伤及重塑过程中维持软骨组织内环境稳定，特别是软骨细胞凋亡对OA 软骨破坏起着关键性作用。已有研究表明，软骨细胞凋亡参与了OA 的发生和发展〔5,6〕。Fas 蛋白是一种含有319个氨基酸的Ⅰ 型跨膜蛋白，可与细胞因子FasL结合传导由FasL引起的细胞凋亡程序。Fas蛋白在正常软骨细胞内有一定水平的表达，介导软骨细胞处于凋亡与增殖的动态平衡之中。Kim等〔7〕研究报道鸟苷代谢物通过增强Fas-FasL相互作用诱导软骨细胞凋亡，表明软骨细胞中Fas/FasL信号传导通路异常可能通过介导软骨细胞凋亡参与OA发生和发展过程。Tu 等〔8〕报道也证实OA 软骨细胞中Fas蛋白较正常软骨组织细胞高表达。本研究也发现与正常人相比，OA患者骨关节软骨组织中Fas蛋白明显高表达。因此，本文推测Fas蛋白表达增加可能是OA的发病机制之一。

在某些病理情况下，基因增强子区域CpG岛的甲基化干扰一些转录因子与基因调控区的结合或直接抑制RNA聚合酶活性而抑制基因的表达。Petak等〔3〕发现结肠癌患者癌组织细胞中Fas基因增强子区域DNA甲基化降低了Fas蛋白的表达并且抑制了Fas介导的细胞凋亡。Thaler等〔9〕发现小鼠原成骨细胞中Fas蛋白的表达下降与Fas基因的异常甲基化有密切关系。Jones等〔10〕发现Sezary综合征中Fas基因的蛋白表达下降与Fas基因的高甲基化有关。因此，本文推测OA患者骨关节组织中Fas蛋白高表达可能与Fas基因增强子区甲基化异常有关。

Fas基因低甲基化改变后，转录因子与低甲基化的增强子区域的DNA的结合，促进Fas基因的转录和表达，导致Fas基因蛋白表达增加，而Fas蛋白的异常高表达，增加了Fas/FasL介导的细胞凋亡，使软骨细胞凋亡增加，最终参与了骨关节炎的发生和发展。

1 Wang F,Wu L,Li L,etal.Monotropein exerts protective effects against IL-1β induced apoptosis and catabolic responses on osteoarthritis chondrocytes〔J〕.Int Immunopharmacol,2014;23(2):575-80.

2 Hoa T,Hasunma T,Aono H,etal.Novel mechanisms of selective apoptosis in synovial T cells of with rheumatoid arthritis〔J〕.J Rheumatol,1996;23(7):1331-6.

3 Petak I,Danam RP,Tillman DM,etal.Hypermethylation of the gene promoter and enhancer region can regulate Fas expression and sensitivity in colon carcinoma〔J〕.Cell Death Differ,2003;10(2):211-7.

4 de Andrés MC,Imagawa K,Hashimoto K,etal.Loss of methylation in CpG sites in the NF-κB enhancer elements of inducible nitric oxide synthase is responsible for gene induction in human articular chondrocytes〔J〕.Arthritis Rheum,2013;65(3):732-42.

5 Zamli Z,Robson Brown K,Tarlton JF,etal.Subchondral bone plate thickening precedes chondrocyte apoptosis and cartilage degradation in spontaneous animal models of osteoarthritis〔J〕.Biomed Res Int,2014;2014：1-10.

6 Zamli Z,Adams MA,Tarlton JF,etal.Increased chondrocyte apoptosis is associated with progression of osteoarthritis in spontaneous Guinea pig models of the disease〔J〕.Int J Mol Sci,2013;14(9):17729-43.

7 Kim DJ,Chung JH,Ryu EK,etal.Metabolic loading of guanosine induces chondrocyte apoptosis via the Fas pathway〔J〕.Exp Mol Med,2006;38(4):401-7.

8 Tu Y,Xue H,Francis W,etal.Lactoferrin inhibits dexamethasone-induced chondrocyte impairment from osteoarthritic cartilage through up-regulation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 and suppression of FASL,FAS,and Caspase 3〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2013;441(1):249-55.

9 Thaler R,Karlic H,Spitzer S,etal.Extra-cellular matrix suppresses expression of the apoptosis mediator Fas by epigenetic DNA methylation〔J〕.Apoptosis,2010;15(6):728-37.

10 Jones CL,Wain EM,Chu CC,etal.Downregulation of Fas gene expression in Sézary syndrome is associated with promoter hypermethylation〔J〕.Invest Dermatol,2010;130(4):1116-2.

〔2016-01-30修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

彭 丹(1966-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事骨性疾病发生机制研究。

陈 夏(1984-)，男，博士，主治医师，主要从事骨性疾病发生机制研究。

R684.3

A

1005-9202(2017)13-3188-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.028

1 湖南中医药大学医学院生物化学与分子生物学教研室

2 湖南中医药大学干细胞调控与应用实验室