穿心莲内酯通过核因子-κB通路对口腔鳞癌细胞的抑制及其作用机制

申 俊 王 炫 高 峰 孟文霞

(广东省口腔医院牙周黏膜科，广东 广州 510280)

穿心莲内酯通过核因子-κB通路对口腔鳞癌细胞的抑制及其作用机制

申 俊 王 炫 高 峰 孟文霞

(广东省口腔医院牙周黏膜科，广东 广州 510280)

目的 探究穿心莲内酯对人口腔鳞癌(OSCC)细胞抑制作用及其机制。方法 MTT实验检测穿心莲内酯对SAS人OSCC细胞系增殖的作用；Western印迹检测穿心莲内酯对SAS人OSCC细胞系中p65、p65(Ser536)和cyclin D1表达的影响；细胞免疫荧光实验检测穿心莲内酯对SAS人OSCC细胞系中p65(Ser536)和cyclin D1表达的影响。结果 MTT实验表明穿心莲内酯可抑制SAS人OSCC细胞系增殖并且其抑制作用呈剂量、时间依赖性(P<0.05)；Western印迹以及细胞免疫荧光实验结果显示穿心莲内酯可降低p65磷酸化以及cyclin D1表达(P<0.05)。结论 穿心莲内酯可以通过抑制p65磷酸化减少cyclin D1表达，从而降低核因子(NF)-κB活性抑制SAS人OSCC细胞系增殖。穿心莲内酯可以作为治疗OSCC的潜在新型药物。

穿心莲内酯；NF-κB信号通路；SAS人口腔鳞癌细胞系

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是头颈部最常见的癌症，容易发生侵袭和转移，从而对患者的生活质量和生命产生极大的危害〔1〕。穿心莲是传统中药材，在亚洲各国中广泛用于缓解喉咙痛、腹泻和其他炎症症状〔2〕。穿心莲内酯属于二萜内酯类化合物，从穿心莲中分离，是其主要的生物活性成分〔3，4〕。最近，国内外有多篇文献报道穿心莲内酯及其衍生物在抗感染、抗肿瘤方面具有显著作用，包括穿心莲内酯抑制肝癌细胞和前列腺癌细胞增殖〔5，6〕。穿心莲内酯可以通过死亡受体介导通路诱导细胞凋亡〔7〕，通过抑制ERK1/2通路，诱导肿瘤坏死细胞(TNF)-α合成并且刺激毒性T淋巴细胞产生从而抑制体内肿瘤生长〔8〕。穿心莲内酯还可以抑制肿瘤引起的血管生成，通过降低血管内皮生长因子(VEGF)、一氧化氮(NO)和多种炎症细胞因子和化学因子的表达，增加抗血管生成因子表达〔9〕。然而穿心莲内酯抑制肿瘤的具体作用机制还不清楚。核因子(NF)-κB是一种重要的肿瘤调控因子，NF-κB家族包括p105/p50 (NF-κB1)、p100/p52 (NF-κB2)、p65 (RelA)、RelB，和c-Rel，其中p50/p65异质二聚体分布最为广泛〔10〕。p50/p65异质二聚体位于细胞质并在细胞质与IκB抑制蛋白结合。一旦激活，IκB蛋白可迅速被IκB激酶α和β(IKKα和IKKβ)快速磷酸化，然后被泛素-蛋白酶体通路降解〔11〕，p50/p65异质二聚体迁移到核转录，上调下游基因从而调控先天免疫、炎症、细胞生长及凋亡〔12〕。因此，NF-κB的激活需要IKKα和β磷酸化p65使p65从IKK复合物中释放〔13〕。NF-κB的持续活化可以促进肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡，促进血管的新生以及促进肿瘤细胞的转移。 既往有研究提示，NF-κB通路可能是穿心莲内酯的主要作用靶点〔14〕，但其具体的作用机制仍不明了。本研究拟观察穿心莲内酯对OSCC SAS细胞生长增殖及其对NF-κB信号通路蛋白的影响。

1 资料与方法

1.1 主要试剂 高糖DMEM培养基，胎牛血清(FBS)，青-链霉素购自美国Invitrogen，穿心莲内酯购自美国Sigma-Aldrich公司，p65、p65(Ser536)和cyclin D1购自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 细胞来源及培养 SAS人OSCC细胞系购自ATCC(American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA)，SAS细胞在高糖培养基中培养，同时在培养基中加入10%FBS和1%青霉素-链霉素，在37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3 方法

1.3.1 MTT实验 SAS细胞系接种于96孔板，每孔接种细胞数为0.5×104个。接种24 h之后分两组处理，每组设置5个复孔。一组用不同浓度的穿心莲内酯处理SAS细胞48 h，浓度分别为0、25、50、100 μmol/L(穿心莲内酯溶解于DMSO)；另外一组用50 μmol/L穿心莲内酯处理细胞24、48、72 h。之后两组加入20 μl MTT工作液，培养4 h。弃掉培养基，每孔加200 μl DMSO，震荡溶解结晶物，在酶联免疫检测仪490 nm处检测吸光值。

1.3.2 Western印迹实验 用不同浓度穿心莲内酯(0、25、50和100 μmol/L)处理SAS细胞系48 h后，弃掉培养基，PBS洗涤细胞，然后加细胞裂解液RIPA(蛋白酶抑制剂：RIPA=1∶1 000)，冰上裂解30 min，刮蛋白。4℃，13 000 r/min，离心13 min后吸上清液转移到另外一支EP管，用BCA工作液检测蛋白含量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，分离后电转到PVDF上，5%牛奶封闭1 h。用TBST洗膜3次，5 min/次。孵育p65抗体、p65(Ser536)抗体、cyclin D1抗体和GAPDH抗体过夜。TBST洗膜3次，5 min/次。孵育相应的辣根过氧化物酶连接的二抗，TBST洗膜3次，10 min/次。 撒发光液，用自动显影仪显影并分析条带灰度。

1.3.3 细胞免疫荧光实验 SAS细胞系接种于6孔板中，每孔密度为4×105个。实验组细胞与100 μmol/L穿心莲内酯孵育48 h，对照组细胞与DMSO溶液孵育48 h。两组细胞用多聚甲醛溶液固定20 min，之后与0.5% Triton X-100孵育10 min。PBS洗涤，3次，5 min/次。将固定的细胞与4%的BSA溶液在室温封闭2 h，之后用适当比例的p65(Ser536)和cyclin D1抗体4℃孵育过夜。PBS洗涤3次，5 min/次。不同二抗37℃孵育1 h(山羊抗兔的FITC标记的二抗和山羊抗小鼠的Cy3标记的二抗)，在荧光显微镜下观察。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 穿心莲内酯对SAS细胞系的细胞毒性作用 MTT实验表明穿心莲内酯可以显著抑制SAS细胞系增殖，并且具有浓度、时间依赖的关系(P<0.05)。

2.2 Western印迹 p65(Ser536)磷酸化可以表明NF-κB活性，cyclin D1是NF-κB下游调节基因〔14〕。随着穿心莲内酯浓度增加，p65含量没有变化，但磷酸化p65(Ser536)含量以及cyclin D1含量减少(P<0.05)。见图1。

A：不同浓度穿心莲内酯(0、25、50、100 μmol/L)作用于p65、p65(Ser536)、cyclin D1；B：将相关蛋白表达情况与内参GAPDH比值量化成直方图，其中AG是穿心莲内酯，分别为浓度0、25、50、100 μmol/L；1)P<0.05，2)P<0.01图1 Western印迹检测结果

2.3 免疫荧光实验 免疫荧光实验结果表明穿心莲内酯(100 μmol/L)可以抑制p65(Ser536)(绿色)与cyclin D1(红色)的表达。见图2。

图2 用100 μmol/L穿心莲内酯处理SAS细胞系48 h之后p65(Ser536)(绿色)和cyclin D1(红色)免疫染色情况

3 讨 论

穿心莲有多种药理作用，例如抗肿瘤、抗HIV、抗病毒感染以及血管保护功能〔1〕。穿心莲主要活性成分为二萜内酯、黄酮、多酚等物质，其中最主要的成分为穿心莲内酯，其被认为是最重要的治疗成分〔16〕。

据报道，NF-κB活性与肿瘤形成和迁移密切相关〔17〕。NF-κB异常激活可以调节多种肿瘤的病理反应，包括细胞周期过程、增殖以及凋亡。Western印迹实验表明穿心莲内酯可以显著抑制p65(Ser536)与cyclin D1，同时免疫荧光实验显示穿心莲内酯同样可以抑制p65(Ser536)与cyclin D1，通过NF-κB家族成员p65磷酸化减少以及下游基因cyclin D1减少说明NF-κB的活性降低。

总之，本研究说明穿心莲内酯通过NF-κB通路对SAS人口腔鳞癌细胞系发挥重要作用，穿心莲内酯通过减弱p65磷酸化以及cyclin D1表达降低NF-κB活性，进而抑制SAS细胞增殖。

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〔2017-01-03修回〕

(编辑 郭 菁)

广东省医学科研基金项目(2016159618)

申 俊(1979-)，女，副主任医师，博士，主要从事口腔黏膜病病因及防治研究。

R73

A

1005-9202(2017)13-3181-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.025