山茱萸多糖对阿尔茨海默病模型大鼠认知能力和海马磷酸化-tau蛋白表达的影响

苏亚楠 张晓波 姚海涛 陈立强

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154002)

山茱萸多糖对阿尔茨海默病模型大鼠认知能力和海马磷酸化-tau蛋白表达的影响

苏亚楠 张晓波1姚海涛1陈立强1

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154002)

目的 观察山茱萸多糖对阿尔茨海默病(AD)大鼠认知能力的影响及作用机制。方法 100只Wistar大鼠随机分为青年组、假手术组、模型组、多奈哌齐组、山茱萸多糖组各20只。采用D-半乳糖联合β-淀粉样蛋白(Aβ)1～40注射建立AD模型。水迷宫实验观察大鼠认知能力，免疫组化(SABC)法检测大鼠海马CA4区磷酸化tau(p-tau)蛋白表达量。结果 药物干预后，山茱萸多糖组平均逃避潜伏期较模型组明显缩短(P<0.05)；120 s穿越原平台次数较模型组明显增加(P<0.05)。山茱萸多糖组海马区p-tau蛋白阳性染色较模型组明显减弱(P<0.05)。结论 山茱萸多糖对AD大鼠认知能力有改善，可能与降低海马区p-tau蛋白表达量相关。

山茱萸多糖；阿尔茨海默病；磷酸化tau蛋白；认知能力

山茱萸多糖是我国传统中药材山茱萸生物学活性物质的重要成分，现已明确其成分主要有木糖和葡萄糖组成的多糖(PFCC)，鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖组成的多糖(PFCAⅢ)等〔1〕。研究显示〔2〕多糖有抗氧化、调节和增强免疫功能、抗衰老、保护心脑血管系统等作用。本实验观察β-淀粉样蛋白(Aβ)1～40诱导制备阿尔茨海默病(AD)大鼠模型经山茱萸多糖干预后学习记忆能力改变、磷酸化tau(p-tau)蛋白表达变化及其作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物和分组 清洁级Wistar大鼠100只，3月龄，体重(137.4±12.7)g。常规饲养，随机分为青年组、假手术组、模型组、多奈哌齐组、山茱萸多糖组，每组20只。

1.2 主要试剂 山茱萸多糖提取物(4∶1)购自朗林生物制品有限公司；Aβ1～40购自无锡亚肽生物科技有限公司；多奈哌齐由法国辉瑞公司生产；兔抗大鼠p-tau抗体(pSer422)由Sigma-Aldrich公司生产；免疫组化(SABC)试剂盒、化学发光底物(ECL)试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司生产。

1.3 模型制备和给药 按60 mg·kg-1·d-1给大鼠腹腔连续注射D-半乳糖。6 w后，山茱萸多糖组、多奈哌齐组、模型组大鼠固定在脑立体定位仪上，依据《大鼠脑立体定位图谱》〔3〕行海马区注射凝聚态Aβ1～40溶液1 μl；假手术组海马区注射等量无菌生理盐水。术后7 d，山茱萸多糖组以0.175 mg·kg-1·d-1灌胃，多奈哌齐组以0.5 mg·kg-1·d-1灌胃，模型组、假手术组以等量生理盐水灌胃，1次/d，连续30 d。

1.4 Morris水迷宫检测 造模后第8天、药物灌胃30 d各组进行Morris水迷宫实验。每次共6 d。①定位航行试验：共5 d，上午和下午两时段，每个时段训练4次，以水池4个象限作为大鼠的入水点至找到平台为止，如大鼠在120 s内找到平台，平台停留30 s；如在120 s未找到平台，将其引至平台停留30 s。记录大鼠轨迹路线图，4个不同象限平均值是该次的逃避潜伏期。②空间探索试验：第6天撤除平台，记录大鼠120 s内穿越原平台位置次数及在原平台所在象限停留时间。

1.5 取材和检测 大鼠灌胃30 d，麻醉后固定于木板平台上，打开胸腔暴露心脏，将灌注针沿左心室插入主动脉，剪开右心耳，0.9%生理盐水灌注心脏，至大鼠四肢苍白；换4%多聚甲醛溶液行心脏灌注。断头取脑，脑组织于4%多聚甲醛溶液中固定。于海马处取材，SABC法检测海马p-tau蛋白表达。胞质内呈现阳性的颗粒为阳性表达，图像采集后用Image-Pro Plus6.0图像分析软件来计算图像中阳性染色的平均光密度值。

1.6 统计学方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，两两比较采用最小显著性差异法(LSD)和S-N-K检验。

2 结 果

2.1 各组逃避潜伏期比较 干预前模型组、多奈哌齐组、山茱萸多糖组逃避潜伏时间较青年组和假手术组明显延长(均P<0.05)；干预后与模型组比较，青年组、假手术组、多奈哌齐组、山茱萸多糖组明显缩短(均P<0.05)。见表1。

表1 各组干预前、后平均逃避潜伏期

与青年组、假手术组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

2.2 各组干预前、后空间探索能力比较 与干预前比较，多奈哌齐组(0.368 1±0.010 2)、山茱萸多糖组干预后穿越原平台次数均明显增加(P<0.05)。见表2。

2.3 各组海马p-tau(Ser422)表达 在海马 CA4区，与青年组(0.316 8±0.011 7)、假手术组(0.319 9±0.013 0)比较，模型组p-tau(Ser422)蛋白(0.402 2±0.014 3)阳性染色明显增强(P<0.05)。与模型组比较，多奈哌齐组(0.368 1±0.010 2)、山茱萸多糖组p-tau(Ser422)蛋白(0.372 3±0.012 1)阳性染色均明显减弱(P<0.05)。而多奈哌齐组，山茱萸多糖组p-tau(Ser422)蛋白阳性染色无明显差别(P>0.05)。见图1。

表2 各组干预前、后120 s内穿越原平台次数,次，n=20)

与青年组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.05；与干预前比较：4)P<0.05

图1 各组海马CA4区p-tau(Ser422)蛋白表达情况(SABC法，×400)

3 讨 论

AD是一种神经退行性疾病，最主要病理特征是老年斑〔4〕和神经纤维缠结(NFTs)〔5，6〕，AD患者痴呆程度与NFTs数量密切相关。tau是神经元中含量最高的微管相关蛋白，tau蛋白被过度磷酸化具有神经毒性〔7，8〕。本实验表明山茱萸多糖在调节AD大鼠海马tau蛋白磷酸化中有积极作用，可改善AD大鼠病理进展，达到防治目的。本实验观察到大鼠在Morris水迷宫实验训练中形成稳定的空间位置认知和空间记忆，从信息加工和提取方式来看属于陈述性记忆，这种认知和记忆主要储存在边缘系统(如海马)和大脑皮层相关脑区。痴呆病人最先受损且损伤重的是陈述性记忆。研究证明〔9〕，功能未受损的海马区对空间学习记忆和获得新信息很重要，Morris〔10〕也证明海马受损大鼠在水迷宫学习中，隐藏平台实验的成绩降低。本实验说明造模大鼠海马功能受到损害，但这种损害造成海马区的神经细胞功能性改变和空间学习、记忆间的关系一直没得到合理解释。Knierim等〔11〕认为这种关系形态学基础是由两种类型神经元组成，一种是定位神经细胞，是构成认知地图的关键因素；一种是方位神经细胞，是构成认知特定方位关键因素。有学者〔12〕认为神经元和神经突触的变化是直接影响AD患者学习、认知和记忆的神经功能基础。本实验说明山茱萸多糖对AD大鼠的学习和记忆能力有改善作用，间接证明对海马区受损神经元和神经突触功能有修复和保护作用。

1 陈巧霞，杨光明，潘 扬.山茱萸功能性成分的提取分离及生物活性研究进展〔J〕.江苏中医药，2016；48(1)：82-5.

2 杨 雪，季 红，刘颖男，等.山茱萸多糖提取纯化方法及药理作用研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(8)：1984-6.

3 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱〔M〕.北京：人民卫生出版社，1991：44.

4 Beach TG，Sue LI，Walker DG，etal.Striatal amyloid plaque density predicts Braak neurofibrillary stage and clinicopathological Alzheimer′s disease：implications for amyloid imaging〔J〕.J Alzheimers Dis，2012；28(4)：869-76.

5 Lasagna-Reeves CA，Castillo-Carranza DL，Sengupta U，etal.Identification of oligomers at early stages of tau aggregation in Alzheimer′s disease〔J〕.FASEB J，2012；26(5)：1946-59.

6 Miyashita A，Hatsuta H，Kikuchi M,etal.Genes associated with the progression of neurofibrillary tangles in Alzheimer′s disease〔J〕.Transl Psychiatry，2014；4：e396.

7 Khan SS，Bloom GS.Tau：the center of a signaling nexus in Alzheimer′s disease〔J〕.Front Neurosci，2016；10：31.

8 Höglund K，Fourier A，Perret-Liaudet A，etal.Alzheimer′s disease--recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria〔J〕.Clin Chim Acta，2015；449：3-8.

9 Cornwell BR，Overstreet C，Grillon C.Spontaneous fast gamma activity in the septal hippocampal region correlates with spatial learning in humans〔J〕.Behav Brain Res，2014；261：258-64.

10 Morris RG.Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat〔J〕.Neurosci Methods，1984；11(1)：47-60.

11 Knierim JJ，Kudrimoti HS.Learned interaction of visual and idiothetic cues in the control of place field orientation〔J〕.Exp Brain Res，1998；80(1)：135-42.

12 Berchtold NC，Coleman PD，Cribbs DH，etal.Synaptic genes are extensively downregulated across multiple brain regions in normal human aging and Alzheimer′s disease〔J〕.Neurobiol Aging，2013；34(6)：1653-61.

〔2016-07-15修回〕

(编辑 王一涵)

黑龙江省卫生厅项目(2013-233)；佳木斯大学面上项目(L2012-052)；佳木斯大学附属第一医院培育课题(jy2014-005)

陈立强(1979-)，男，实验师，硕士，主要从事神经-体液-免疫调节机制研究。

苏亚楠(1978-)，女，主管护师，硕士，主要从事老年痴呆研究。

R34

A

1005-9202(2017)13-3152-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.013

1 佳木斯大学基础医学院