阿米洛利对氯胺酮麻醉大鼠神经细胞凋亡及神经细胞活性物质的影响

李新帅

(南阳市中心医院麻醉科，河南 南阳 473000)

阿米洛利对氯胺酮麻醉大鼠神经细胞凋亡及神经细胞活性物质的影响

李新帅

(南阳市中心医院麻醉科，河南 南阳 473000)

目的 探讨阿米洛利对氯胺酮麻醉大鼠神经细胞凋亡及神经细胞活性物质的影响。方法 选取60只成年雄性SD大鼠，根据随机数字表将大鼠分为生理盐水5 ml·kg-1·h-1组(对照组)、氯胺酮组40 mg·kg-1·h-1，氯胺酮40 mg·kg-1·h-1+阿米洛利5.0 mg·kg-1·h-1组，每组20只，每天持续静脉注射2 h，连续给药7 d，最后1次给药24 h后应用Morris水迷宫测试各组大鼠空间记忆能力。水迷宫试验结束后处死各组大鼠取出脑海马组织，分别应用TUNEL法及免疫组化法检测神经元细胞凋亡指数及Bax、Bcl-2表达，酶联免疫吸附(ELISA)法测定海马组织匀浆中神经营养因子(NT)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)及乙酰胆碱(Ach)水平。结果 实验第1天氯胺酮组、氯胺酮+阿米洛利组逃避潜伏时间显著长于对照组(P<0.05)，随着实验时间延长，氯胺酮组、氯胺酮+阿米洛利组逃避潜伏期时间显著延长(P<0.05)，但氯胺酮+阿米洛利组各时间段逃避潜伏期时间均短于氯胺酮组(P<0.05)。氯胺酮组、氯胺酮+阿米洛利组大鼠海马神经元细胞凋亡指数、Bax、Bcl-2阳性细胞数量均高于对照组(P<0.05)，而氯胺酮组大鼠海马神经元细胞凋亡指数、Bax、Bcl-2阳性细胞数量均高于氯胺酮+阿米洛利组(P<0.05)。氯胺酮组海马匀浆中NT、NGF、BDNF、 Ach水平低于氯胺酮+阿米洛利组(P<0.05)，而氯胺酮+阿米洛利组海马匀浆中NT、NGF、BDNF、 Ach水平低于对照组(P<0.05)。结论 阿米洛利对氯胺酮麻醉后认知功能障碍的改善可能与其抑制神经细胞凋亡及调节神经细胞活性物质水平有关。

阿米洛利；氯胺酮；神经细胞凋亡；神经细胞活性物质

术后认知功能障碍是外科全麻手术患者常见的并发症，患者表现为记忆功能下降及认知功能损伤〔1〕。氯胺酮麻醉后认知功能障碍发生率较高，目前认为与氯胺酮降低脑组织中神经细胞活性物质促使炎症介质释放而诱发神经元损伤有关〔2〕。阿米洛利属于保钾利尿药物，除了能阻断钠离子通道外，同时对神经中枢多种离子通道有明显的阻滞效果〔3〕。由于阿米洛利可通过阻滞钠离子通道从而参与神经病理调节过程，减轻酸化及缺血灌注所致的神经元损伤，因此对神经元功能具有保护作用〔4〕。本研究探讨阿米洛利对氯胺酮麻醉大鼠认知功能的保护作用及相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取60只成年雄性SD大鼠，重量180～200 g，购于河南省医学实验动物中心，动物使用许可证号：SYXK(豫)2014-0008。所有大鼠常规喂养，室内温度设定为20℃～25℃，湿度控制在60%～70%，灯光昼夜节律控制(8：00～20：00)。

1.2 主要试剂 复方盐酸阿米洛利片(苏州东瑞制药有限公司，批准文号：国药准字H10900015)；盐酸氯胺酮注射液(西安汉丰药业有限责任公司，批准文号：国药准字H20054748)；0.9%氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司；批准文号：国药准字H20056626)；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；兔抗鼠Bax一抗(艾美捷科技有限公司)；兔抗鼠Bcl-2一抗(上海康朗生物科技有限公司)；羊抗兔二抗(南京生兴生物技术有限公司)；神经营养因子(NT)试剂盒(上海凯博生化试剂有限公司)；神经生长因子(NGF)试剂盒(上海酶联生物技术有限公司)；脑源性神经营养因子(BDNF)试剂盒(上海纪宁实业有限公司)；乙酰胆碱(Ach)试剂盒(上海凯博生化试剂有限公司)。

1.3 主要仪器 手术器械(上海医疗器械设备厂)；超声波清洗仪(型号：SKE-5S；宁波科麦仪器有限公司)；微量加样器(北京华仪三谱仪器有限责任公司)；电子分析天平(型号：BT125D；赛多利斯仪器有限公司)；秒表(型号：AMP-ZSD-013；北京西化仪科技有限公司)；Morris水迷宫测试仪(北京北广精仪仪器设备有限公司)；电子显微镜(深圳电子显微镜生产有限公司)；电热恒温箱(邢台润联科技开发有限公司)；切片机(威士达精密机械有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 分组及建立氯胺酮麻醉大鼠模型 根据随机数字表将大鼠分为生理盐水组(对照组)、氯胺酮组(氯胺酮组)，氯胺酮+阿米洛利组，每组20只。所有大鼠均行尾部静脉注射，对照组注射生理盐水5 ml·kg-1·h-1，氯胺酮组缓慢推注氯胺酮40 mg·kg-1·h-1，氯胺酮+阿米洛利组缓慢推注氯胺酮40 mg·kg-1·h-1+阿米洛利5.0 mg·kg-1·h-1，上述各组大鼠每天恒速输注2 h，持续7 d。静脉输注过程中密切留意大鼠呼吸强度，并适时调整输注速度，维持呼吸频率>50次/min，麻醉过程中观察气血，排除血气异常大鼠，剔除给药过程中死亡的大鼠，余下大鼠于固定时间开始水迷宫测试。

1.4.2 水迷宫实验测试 分别于实验第1、3、5、7天从每组中选出10只大鼠进行水迷宫实验，水迷宫由直径130 cm×高50 cm的圆形水池组成，水深30 cm，池水恒温，池壁上标有东南西北4个入水点，可将水池分SW、NW、SE、NE等4个象限，在NW象限中央离池壁33 cm处放置直径9 cm×高29 cm的圆形透明平台，并浸没于水下。在池壁周围贴上参照线供大鼠定位平台，并在迷宫上方安装摄像头，记录大鼠行程，训练期间迷宫外参照物保持不变。在正式实验前对大鼠进行2次预实验，第1次将大鼠置于水池边，让大鼠在180 s内套上高台，如在规定时间内大鼠未能上高台，研究人员将引导大鼠，将其置于高台10 s，相隔5 min后再对大鼠进行培训。第2次培训结束5 min后进行决定性实验，在水下放置高台，让实验大鼠在同一水平线出发登上高台，记录各组大鼠平均逃避潜伏期。

1.4.3 海马神经元细胞凋亡检测 水迷宫试验结束24 h后处死各组大鼠取出脑海马组织，经甲醛固定，乙醇梯度脱水后，石蜡包埋，在视交叉海马区行冠状切片，切片厚度为5 μm。应用TUNEL法检测大鼠海马神经元细胞凋亡数，以胞体缩小及细胞核呈棕黄色等形态学特征判断海马神经元细胞凋亡，并随机选取海马区5个高倍视野(×500)，计算海马神经元凋亡指数。

1.4.4 免疫组化法测定Bax、Bcl-2 海马区神经元细胞切片后常温脱蜡加入3%甲醇溶液，常温下山羊血清封闭20 min，加入兔抗Bax单抗及兔抗Bcl-2单抗，置湿盒4℃过夜，生物素标记二抗，室温下静置10 min，加入辣根过氧化酶，室温下静止10 min，滴入DAB显色剂，室温显色5～10 min，中性树脂封片。以细胞核中出现棕黄色染色为Bax阳性、Bcl-2阳性。

1.4.5 ELISA法测定神经细胞活性物质 剥离大鼠海马组织后迅速置于液氮中冷却后研磨制备匀浆，3 000 r/min离心3 min半径5 cm后留取悬浮物，应用ELISA法测定匀浆NT、NGF、BDNF及Ach水平，操作过程严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 统计学方法 应用SPSS19.0软件进行正态分布检验、t检验、方差齐性检验。

2 结 果

2.1 各组大鼠不同时间水迷宫测试 实验第1天氯胺酮组、氯胺酮+阿米洛利组逃避潜伏时间显著长于对照组(P<0.05)，随着实验时间延长，氯胺酮组、氯胺酮+阿米洛利组逃避潜伏期时间显著延长(P<0.05)，但氯胺酮+阿米洛利组各时间段逃避潜伏期时间均短于氯胺酮组(P<0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠神经元细胞凋亡指数、Bax及Bcl-2阳性细胞比较 氯胺酮组、氯胺酮+阿米洛利组大鼠海马神经元细胞凋亡指数、Bax、Bcl-2阳性细胞数量均高于对照组(P<0.05)，而氯胺酮组均高于氯胺酮+阿米洛利组(P<0.05)。见表2。

表1 各组大鼠不同时间水迷宫测试

与对照组比较:1)P<0.05；与氯胺酮组比较:2)P<0.05；下表同

表2 各组大鼠神经元细胞凋亡指数、Bax及Bcl-2阳性细胞比较，个/视野，n=10)

2.3 各组大鼠神经元细胞活性物质水平比较 氯胺酮组海马匀浆中NT、NGF、BD-NF、 Ach水平低于氯胺酮+阿米洛利组(P<0.05)，而氯胺酮+阿米洛利组均低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠神经元细胞活性物质水平比较

3 讨 论

外科全麻后可导致患者认知功能损伤，表现为记忆衰退。氯胺酮属于N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体非竞争性抑制剂，目前研究表明〔5〕，氯胺酮对记忆功能的损害作用可能与其促进海马神经元细胞凋亡及抑制神经活性物质表达有关。屈瀚等〔6〕认为氯胺酮可抑制Ach合成限速酶活性从而降低海马区Ach表达，导致认知功能障碍。刘德君等〔7〕认为氯胺酮对大鼠认知功能损伤的主要原因与其促进神经元细胞大量凋亡有关，外源性给予大鼠NMDA受体拮抗剂可有效保护大鼠神经元细胞，改善大鼠认知功能。阿米洛利属于保钾利尿剂，它可通过阻滞多种离子通道如酸感受离子通道、Na+/Ca2+交换泵等参与机体多项生命活动〔8〕。研究指出〔9〕，阿米洛利对神经系统疾病具有明显的改善作用，它可以降低脑组织损伤后细胞内Na+浓度，抑制Ca2+超载，降低游离脂肪酸及磷脂酶活性，减轻细胞组织水肿，抑制中性粒细胞聚集及细胞凋亡，改善脑组织血流及神经功能损伤。本研究结果提示氯胺酮可损伤大鼠认知功能。而且对氯胺酮麻醉大鼠给予阿迷洛利能有效减轻高浓度氯胺酮对大鼠学习、记忆功能的损害。

中枢神经系统中海马是与认知、记忆、学习等结构有关，海马神经元参与长期记忆过程，神经元间主要通过神经递质释放及转移完成相关信息传递及加工过程，当海马区神经细胞变性、凋亡后会导致信号传递功能异常而影响记忆功能〔10〕。Bax、Bcl-2蛋白是与神经元相关凋亡蛋白，当神经元Bax、Bcl-2蛋白表达水平升高，则提示海马区细胞凋亡数量增加〔11〕。本研究结果提示氯胺酮麻醉大鼠记忆功能的损伤可能与氯胺酮可促使神经元细胞凋亡，上调Bax、Bcl-2蛋白水平有关。而且对氯胺酮麻醉大鼠给予阿米洛利可有效抑制神经元细胞凋亡，拮抗Bax、Bcl-2蛋白表达，从而减轻大鼠麻醉后认知功能的损伤。NT、NGF、BD-NF等神经活性物质在促进神经元细胞生长及修复受损神经元中起到重要的作用，而Ach是脑内广泛分布的重要神经递质，与记忆及学习能力有密切的关系，其含量多少与学习记忆能力有直接的关系〔12〕。本研究结果提示阿米洛利除了抑制神经元细胞凋亡外，还可通过上调神经活性物质水平而起到改善大鼠认知功能的作用。

1 陈 琛,徐光红,李元海，等.麻醉与老年患者术后认知功能障碍的研究进展〔J〕.安徽医科大学学报,2014;49(1):133-6.

2 赵艳梅,杨丽梅,李 倩，等.氯胺酮、咪达唑仑复合麻醉对大鼠认知功能的影响〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(16):4609-10.

3 Ou-Yang TP,Zhu GM,Ding YX,etal.The effects of amiloride on seizure activity,cognitive deficits and seizure-induced neurogenesis in a novel rat model of febrile seizures〔J〕.Neurochem Res,2016;41(4):933-42.

4 杨飞飞,李光来.阿米洛利对神经系统疾病治疗作用的研究进展〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志,2014;12(9):1136-8.

5 钟 娜,赵 敏.氯胺酮对人类认知功能的影响及神经生物学基础〔J〕.中华精神科杂志,2013;46(6):377-80.

6 屈 瀚,梁 超,徐聪杰,等.异丙酚减轻氯胺酮麻醉对幼年大鼠海马神经元和认知功能损害研究〔J〕.中华生物医学工程杂志,2016;22(3):220-3.

7 刘德君,董铁立.丙泊酚和氯胺酮对幼年大鼠认知及免疫功能的影响〔J〕.中华实验外科杂志,2015;32(11):2751-3.

8 Stelmashook EV,Novikova SV,Amelkina GA,etal.Acidosis and 5-(N-ethyl-N-isopropyl)amiloride(EIPA) attenuate zinc/kainate toxicity in cultured cerebellar granule neurons〔J〕.Biochemistry(Mosc),2015;80(8):1065-72.

9 Suslak TJ,Watson S,Thompson KJ,etal.Piezo is essential for amiloride-sensitive stretch-activated mechanotransduction in larval drosophila dorsal bipolar dendritic sensory neurons〔J〕.PLoS One,2015;10(7):e0130969.

10 周艾婧,邓 娟,汤 艳,等.高尿酸对大鼠认知功能及海马神经元氧化应激和凋亡的影响〔J〕.中华行为医学与脑科学杂志,2016;25(5):422-6.

11 陈 欣,王 伟,张建芳,等.右美托咪定对氯胺酮麻醉致幼龄大鼠海马神经元凋亡的影响〔J〕.中华麻醉学杂志,2015;35(7):794-7.

12 张培福,宋建平,姚泽宇,等.阿米洛利对异氟醚麻醉后大鼠神经活性物质含量及认知功能的影响〔J〕.中国老年学杂志,2016;36(12):2871-2.

〔2017-03-22修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

河南省科技厅科技发展计划(No.14A320003)

李新帅(1983-)，男，主治医师，主要从事麻醉与镇痛研究。

R614

A

1005-9202(2017)13-3150-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.012