枸杞多糖在白血病患者中的应用及对HL-60和NK细胞杀伤活性的影响

2017-07-18肖芳吴琦

中国老年学杂志 2017年13期

关键词：靶细胞枸杞白血病

肖芳吴琦

(广州中医药大学，广东广州 510000)

枸杞多糖在白血病患者中的应用及对HL-60和NK细胞杀伤活性的影响

肖芳吴琦1

(广州中医药大学，广东广州 510000)

目的探讨枸杞多糖在白血病患者中的应用及对人前髓细胞HL-60表面靶细胞表面相应配体(MICA)蛋白表达水平和自然杀伤(NK)细胞杀伤活性的影响及机制。方法取白血病患者HL-60细胞，随机分为观察1组、观察2组及观察3组，分别放入浓度为6、8、10 mg/ml枸杞多糖共同培养，未经枸杞多糖作用的30例白血病患者HL-60细胞为对照组，采用流式细胞仪测定4组细胞表面MICA蛋白表达水平。将4组获得的溶液与NK细胞相互混合，20 h后采用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测NK细胞对4组HL-60细胞的杀伤活性进行测定。结果观察1组MICA表达率显著低于观察2组、观察3组(P<0.05)；观察1组、观察2组、观察3组MICA表达率高于对照组(P<0.05)；随着靶细胞、效应细胞比的不断增加，4组NK细胞杀伤活性均出现上升趋势；观察1组、观察2组及观察3组NK细胞杀伤活性高于对照组(P<0.05)；观察3组NK细胞杀伤活性，高于观察1组、观察2组(P<0.05)。结论白血病患者体内HL-60细胞在枸杞多糖的孵育下能提高细胞MICA表达率，且呈浓度正相关性。同时，枸杞多糖能提高机体内NK细胞的杀伤活性，能清除微小病灶。

枸杞多糖；白血病；HL-60细胞；MICA表达率；自然杀伤细胞；杀伤活性

自然杀伤(NK)细胞属于人体的免疫细胞，是机体的第一道防御屏障，在抑制肿瘤的生长、增殖中发挥重要的作用，其杀伤活性与细胞表面受体、靶细胞表面配体关系密切〔1〕。白血病属于血液性肿瘤，死亡率、复发率较高〔2〕。目前，临床上对于白血病以化疗、异基因造血干细胞抑制治疗为主。随着医疗技术的不断发展，以NK细胞活化受体与配体(MICA-NKG2D)靶向治疗在白血病患者中得到应用，该方法采用MICA抗体封闭的白血病细胞株能提高NK细胞杀伤作用，治疗效果更加敏感。白血病患者与NK细胞敏感性关系表明〔3〕，MICA对肿瘤具有生长抑制作用，能激发NK细胞和T细胞免疫。但是，人体中NK细胞数量相对较少，在外周淋巴细胞中仅占5%～15%。枸杞中含有植物多糖、蛋白质等营养成分，能发挥“补益精气”等功效。文献报道，枸杞多糖中含有多种耐药逆转活性物质，通过调节机体免疫能杀死肿瘤细胞，提高机体免疫和细胞杀伤活性，但是该结论尚未得到进一步证实。本文旨在探讨枸杞多糖在白血病患者中的应用及对人急性早幼粒白血病细胞(HL-60)表面MICA蛋白表达水平和NK细胞杀伤活性的影响及机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料于2014年1月至2016年6月取90例白血病患者HL-60细胞，随机分为观察1组、观察2组及观察3组，每组30例。其中男54例，女36例，年龄15～74〔平均(32.6±2.5)〕岁。未经枸杞多糖作用的30例白血病患者HL-60细胞为对照组。其中男18例，女12例，年龄16～75〔平均(33.1±2.7)〕岁，纳入标准：①符合白血病临床诊断标准；②经生化指标检验，病理学测定确诊。排除标准：①合并有影响效应指标观测、判断其他生理或病理者；②合并严重心、肝、肾功能异常者；③合并传染性疾病及意识不清或存在精神障碍者。

1.2 仪器及试剂 RPMI-1640粉剂(美国Gibco公司)；枸杞多糖(纯度98%)(宁夏紫金花药业股份有限公司)；FITC标记的山羊抗小鼠IgG(美国eBioscience公司)；CO2细胞培养箱(日本SANYO牌)；低速离心机(北京医用离心机厂)；Olympus倒置显微镜(OlympuS公司)；FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson公司)；WellscanMK3酶标仪(Labsystems Dragon公司)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 ①HL-60培养。将分离获得的HL-60放置在浓度为10.0%胎牛血清的RPMI1640培养基中，37℃、5%CO2孵箱内培养，观察培养瓶中培养基颜色的变化，每3 d换液1次，600 r/min离心5 min，去除上层清液采用吸管吹打混合均匀后添加完全培养液，继续在37℃、5%CO2孵箱内培养。采集细胞，600 r/min离心5 min，去除上层清液。调整细胞浓度1×106/ml，分别加入浓度为6、8、10 mg/ml枸杞多糖共同培养，37℃、5%CO2孵箱内培养，设立对照孔。48 h后收集细胞，1 200 r/min离心10 min，用于测定各组MICA表达率。②NK细胞培养。将获得的NK细胞接种在浓度为10.0%胎牛血清的RPMI1640培养基中，37℃、5%CO2孵箱内培养，观察培养瓶中培养基颜色的变化，每4～5 d换液1次，800 r/min离心10 min，去除上层清液，采用尖吸管吹打混合后加入完全培养液，37℃、5%CO2孵箱内进行培养。③混合培养。将HL-60作为靶细胞，加入浓度为10.0%胎牛血清的RPMI1640培养基，调整细胞浓度1×104/ml接种在96孔板中，每孔50 μl，以NK作为效应细胞，根据靶细胞、效应细胞比5∶1、10∶1、20∶1调整细胞浓度，混合后放入37℃、5%CO2孵箱内进行培养，设置单细胞靶孔为对照组〔5〕。

1.3.2 HL-60表面MICA表达及NK细胞杀伤活性测定 (1)MICA表达。采集3种经枸杞多糖作用后的HL-6，放入离心管中，1 200 r/min离心10 min，去除上层清液，采用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，调整细胞浓度为1×107/ml，分管后每管加入1×106/0.1 ml细胞悬液，并加入MICA单抗，4℃下进行30 min标记，加入PBS洗涤液，1 500 r/min离心5 min，加入100 μl FITC标记的山羊抗鼠IgG，4℃下进行30 min标记，加入PBS洗涤液洗涤2次，然后上流式细胞仪检测，以对照管作为空白定标，分析4组细胞中阳性细胞表达率〔6〕。(2)NK细胞杀伤活性测定。取枸杞多糖处理后的HL-60和NK细胞混合溶液，培养20 h后向每孔中加入10 μl噻唑蓝(MTT)溶液，37℃、5%CO2孵箱内进行24 h培养，使得沉淀充分溶解，采用WellscanMK3酶标仪测定波长在570 nm下各孔的吸光度值〔9〕。细胞杀伤活性=〔1-(Ae+t-Ae)/At〕×100.0%。Ae+t：杀伤孔OD值；Ae为单纯效应细胞OD值；At单纯靶细胞OD值。

1.4 统计学方法应用SPSS18.0软件进行χ2、t检验。

2 结果

2.1 4组HL-60 MICA表达水平比较观察1组MICA表达率〔(65.02±2.24)%〕显著低于观察2组〔(42.29±1.57)%〕、观察3组〔(10.34±0.91)%〕(P<0.05)；观察1组、观察2组、观察3组MICA表达率显著高于对照组〔(6.34±0.81)%〕(P<0.05)。

表1 4组NK细胞杀伤活性比较

与对照组比较：1)P<0.05；与观察3组比较：2)P<0.05

2.2 4组NK细胞杀伤活性比较见表1。随着靶细胞、效应细胞比的不断增加，4组NK细胞杀伤活性均出现上升趋势；观察1组、观察2组及观察3组NK细胞杀伤活性显著高于对照组(P<0.05)；观察3组NK细胞杀伤活性显著高于观察1组、观察2组(P<0.05)。

3 讨论

目前，临床上对于白血病多以大剂量联合化疗为主，该方法虽然能改善患者症状，但是长期疗效欠佳，仅有不到40.0%患者能获得长期生存，且患者5年生存率较低〔8〕。随着医疗技术的不断发展，免疫治疗在白血病患者中得到应用，该方法无论在原发性白血病还是复发性白血病患者中均能获得较高的缓解率。免疫治疗主要通过增强或抑制免疫功能对机体进行有效的改善，从而能提高机体免疫干预，达到治疗的目的。同时，免疫治疗能有效清除残余的恶性肿瘤，提高肿块抗原免疫原性，从而提高机体细胞免疫应答。体外研究显示〔9〕，NK细胞对多种肿瘤具有细胞毒活性，能有效改善患者症状，延长患者寿命。但是人体中NK细胞数量相对较少，治疗时长期疗效欠佳，临床需要采取有效的措施提高NK细胞数量。

为了进一步提高NK细胞的杀伤活性，必须要降低抑制信号水平，提高激活信号水平，从而对冲抑制性信号，形成刺激性信号的强势，最终杀灭肿瘤细胞。文献报道〔10〕，通过药物干预能有效提高肿瘤细胞表面mMICA表达水平，进一步激活NK细胞对肿瘤的细胞杀伤活性，而sMICA对于机体抗肿瘤能发挥其负调节作用，是否存在药物进行有效的干预尚需要进一步研究和探讨。组蛋白取乙酰化抑制剂丙戊酸钠能有效提高肝癌表面的MICA水平，从而能有效提高NK细胞杀伤活性。患者用药后机体内的曲骨霉素A、维生素D3等均会随着白血病细胞的上NKG2D配体表达。部分靶分子药物能有效地提高肿瘤细胞的表达能力，直接作用在肿瘤细胞的内外源性凋亡途径的多个靶点，从而能上调NK细胞活化受体的配体，能有效地提高肿瘤细胞对NK细胞的杀伤敏感性。本研究结果提示枸杞多糖在白血病患者中能发挥重要的作用。

目前，枸杞多糖是临床上常用的治疗药物，该药物具有增强免疫功能和抗肿瘤等效应，药物能从降低抑制性信号水平、提高激活性信号水平，形成刺激性信号的强势，从而杀死肿瘤细胞。国外学者研究显示，枸杞多糖具有良好的抗肿瘤和调节机体免疫等药理作用〔4〕。本研究结果提示机体中MICA表达的提高能进一步提高白血病细胞对于患者NK细胞的介导作用，能有效提高细胞杀伤能力，即MICA水平的高低决定了白血病患者治疗效果及预后情况，通过采用枸杞多糖能有效提高患者MICA水平，从而能提高NK细胞杀伤活性，改善患者预后，促进患者早期恢复，降低治疗后复发率。因此，临床上对于白血病的治疗可以在患者身体状况允许下适当采用枸杞多糖，提高机体免疫，从而能有效改善患者症状，通过机体免疫杀死肿瘤，从而改善患者生存质量，使得患者的治疗更具针对性〔11〕。

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9 朱雨，钱思轩，李建勇，等.《地西他滨治疗老年初诊急性髓系白血病的多中心、开放性、Ⅲ期临床试验(注册试验DACO-016)》解读〔J〕.中华血液学杂志，2013;34(1):83-5.

10 常城，杨波，张琳，等.地西他滨联合自体CIK细胞治疗2例高龄急性髓系白血病的疗效观察〔J〕.中国实验血液学杂志，2013;21(1):62-7.

11 马树沛，林梅.地西他滨联合小剂量阿糖胞苷治疗老年急性髓系白血病临床观察〔J〕.中国老年保健医学，2015;29(3):6-8，13.

〔2017-03-22修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

广东省自然科学基金项目(No.10451008901001139)

肖芳(1980-)，女，在读博士，主治医师，主要从事中医内科血液病学研究。