β-arrestin1在非小细胞肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖的影响

刘 晓 胡 岗 陈一凡 廖俊喆 徐 敏 刘 波

(成都市第五人民医院呼吸科，四川 成都 611130)

β-arrestin1在非小细胞肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖的影响

刘 晓 胡 岗 陈一凡 廖俊喆 徐 敏 刘 波

(成都市第五人民医院呼吸科，四川 成都 611130)

目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系和组织中β-arrestin1的表达及β-arrestin1对肺癌细胞增殖能力的影响。方法 收集该院经手术治疗的30例NSCLC患者的癌组织标本(NSCLC组)和肺良性病变边缘正常肺组织标本(对照组)，培养NSCLC细胞系(SPC-A-1、H460、H520、H1975)和人正常肺上皮细胞系16HBE，分别提取NSCLC组、对照组及细胞系总RNA，逆转录后，实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)用于检测β-arrestin1 mRNA的表达，蛋白印迹法(Western印迹)和免疫组化(IHC)分别检测细胞系和组织中的β-arrestin1蛋白的表达水平。MTT实验检测分别转染sh-β-arrestin1质粒和对照质粒sh-control到SPC-A-1细胞后对NSCLC细胞SPC-A-1增殖能力的影响。结果 β-arrestin1 mRNA和蛋白表达水平在NSCLC组织和细胞系中分别高于对照组和16HBE细胞(P<0.05)。转染sh-β-arrestin1质粒后，β-arrestin1 mRNA和蛋白表达水平均显著下调，且在MTT实验中可显著抑制ASPC-A-1的增殖能力(P<0.05)。结论 β-arrestin1在NSCLC组织和细胞系中呈高表达，且可以抑制肺癌细胞的增殖。

非小细胞肺癌；β-arrestin1

非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%。发生转移的晚期NSCLC患者在得不到有效治疗时的中位数生存期仅为4～5个月，1年生存率<10%〔1〕。临床上NSCLC的主要治疗形式包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、综合治疗、靶向治疗及中药治疗等，而不同NSCLC患者对不同治疗方案的敏感性不同，肿瘤自身及机体特异性也会限制治疗方式〔2〕。肿瘤的发生是一个多基因参与的复杂过程，β-arrestin1是Arrestin蛋白家族的成员之一，具有多种功能的信号蛋白，β-arrestin1在肿瘤的增殖、侵袭和转移等过程中发挥重要作用〔3〕，且β-arrestin1可通过与磷酸化的G蛋白耦联受体(GPCR)结合形成β-arrestin1的受体复合物，并以衔接蛋白的形式激活丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)级联反应，导致蛋白激酶B(AKT)和磷酯酰肌醇-3激酶(PI3K)等多种信号通路的激活，促进肿瘤的发生和发展〔4〕。已有研究证实β-arrestin1可促进卵巢癌〔5〕和前列腺癌〔6〕的侵袭或转移，但关于β-arrestin1在NSCLC中的表达及作用的研究极少且不明确，仅有β-arrestin1可促进尼古丁诱导的NSCLC转移〔7〕，β-arrestin1的表达缺失与NSCLC患者的较差预后密切相关〔8〕。本研究旨在探究β-arrestin1对NSCLC细胞增殖能力的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器 兔抗人β-arrestin1单抗和兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多抗(CST，USA)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(博士德，湖北武汉)，β-arrestin1的抑制性慢病毒载体质粒sh-β-arrestin1及对照空载体质粒sh-control(GeneCopoeia构建，USA)，Lipofectamine2000转染试剂、Trizol(Invitrogen，USA)，TaqMan逆转录试剂盒(Life Technologies，USA)，qSYBR-Green-containing PCR kit试剂盒(GeneCopoeia，USA)，蛋白提取试剂盒、增强化学发光法(ECL)试剂盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒(Thermo，USA)，两步法免疫检测试剂盒(Dako，USA)，噻唑蓝(MTT)细胞生长增殖/毒性检测试剂盒(Sigma，USA)，BioRad IQTM5 Multicolor实时荧光定量系统(BioRad，USA)，奥林巴斯正置显微镜 OLYMPUS BX51(Olympus，日本，配合UIS2光学成像系统使用)，ChemiDocTM触摸成像系统(Bio-Rad，USA，配合Image LabTMTouch软件Version 1.0使用)，Multiskan MK 3酶标仪(Thermo，USA)，紫外可见分光光度仪(Thermo，USA，Nanodrop 2000)。

1.2 临床样本 本研究中所有组织样本均来源于成都市第五人民医院2014年1月至2015年12月经手术治疗的30例NSCLC患者(NSCLC组)，标本均经本院病理科证实。NSCLC患者术前均未接受过任何化疗及放疗，其中男和女各15例，年龄25～80岁，平均(56.9±2.3) 岁，分别取30例NSCLC患者的癌病变切除组织和肺良性病变边缘5 cm以上的正常肺组织(对照组)。取术中切除的新鲜组织，立即置于RNAlater中，于-80℃保存，用于后续实验。30例患者的石蜡标本均由本院病理科提供，4 μm厚连续切片10张。该实验的所有过程均遵从赫尔辛基宣言的标准，且该研究得到本院伦理委员会的批准，且患者签署了知情同意书。

1.3 细胞系和细胞培养 NSCLC细胞系(SPC-A-1)细胞，H460，H520，H1975和人正常肺上皮细胞系(16HBE，中国科学院上海生命科学院生化细胞所)均培养于含10%胎牛血清(BSA)的RPMI-1640培养基(Gibco，USA)中，细胞置于37℃，饱和湿度，含5% CO2的细胞培养箱内孵育。

1.4 质粒转染 在SPC-A-1细胞生长汇合度达到80%～90%时收集细胞，用含10% BSA的RPMI-1640培养基稀释至浓度为5×104个/ml的细胞悬液，按2 ml每孔加入6孔板，细胞汇合度约为60%～80%时准备转染。使用无菌EP管配制Lipofectamin 2000和转染试剂(sh-β-arrestin1或sh-control)，两者轻轻混匀，室温放置20 min。将上述混合物与不含抗生素的无血清培养基轻轻混匀，加入到待转染的6孔板中，培养箱中培养6 h后换为常规培养基。48 h后，收集细胞，提取蛋白或RNA，或用于后续实验。

1.5 RNA提取和qRT-PCR检测 取术中新鲜获得的NSCLC组织和正常组织各100 mg，分别加入700 μl TRIzol试剂，充分研磨，(细胞系总RNA提取时每个六孔板中加入100 μl TRIzol试剂，其余试剂均按组织RNA提取时用量的1/7加入)。室温放置5 min后加入氯仿140 ml，剧烈震荡15 s后室温放置5 min，随后4℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上层液体到另一干净的EP管，按照每1 ml Trizol中加入0.5 ml异丙醇的比例加入异丙醇，混匀，室温放置10 min，离心去上清。1 ml 75%乙醇洗涤沉淀，4℃ 7 500 r/min离心5 min，弃上清，室温干燥，加入30 μl无酶水溶解，取1 μl测RNA浓度及纯度，其余-20℃保存备用。

以从组织或细胞系中提取的总RNA为模板，按照TaqMan逆转录试剂盒的说明书进行操作，逆转录生成cDNA后，以cDNA为模板，按照实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)的说明书进行操作，进行CT值的测定。其中GAPDH为内参，2-ΔΔCT用于计算β-arrestin1基因的相对表达量，ΔΔCT =(CT gene-CTGAPDH)target-(CT gene-CTGAPDH)对照，反应体系为20 μl，每组实验设置3个复孔。

1.6 蛋白提取和Western印迹检测 按照蛋白提取试剂盒、ECL试剂盒和BCA蛋白定量检测试剂盒的说明书进行操作，分别提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度。分别取30 μg样本，进行10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳实验。将蛋白转移至聚偏氟丙烯(PVDF)膜上，5%的BSA室温封闭1～2 h，加入1∶5 000的兔抗人β-arrestin1抗体和1∶10 000兔抗人GAPDH抗体4℃过夜。Tirs盐酸缓冲液(TBST)洗膜3次，10 min/次，加入1∶800的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，加入ECL发光剂并曝光，采用ChemiDocTM触摸成像系统扫描并保存蛋白条带的图片。Quantity One软件分析，以目的蛋白β-arrestin1和内参GAPDH的蛋白条带的灰度值比值来确定目的蛋白的相对表达水平，每组实验设置3个复孔。

1.7 MTT法检测β-arrestin1对SPC-A-1细胞增殖能力的影响 将实验分成sh-control组和sh-β-arrestin1组。将sh-control和sh-β-arrestin1分别转染到SPC-A-1细胞中，细胞培养于96孔板中，每组设置6个复孔，在未接种细胞的孔中加入DMEM为调零孔，转染后的细胞在培养箱中培养48 h。随后每孔加入30 μl的MTT试剂，37℃孵育2 h后，每孔中加入150 μl DMSO，低速振荡10 min至使结晶物充分融解。酶标仪测定492 nm波长处的OD492值并记录，每组实验设置3个复孔，对照组为sh-control组。

1.8 免疫组化(IHC) 将切片依次放入二甲苯-二甲苯-100%无水乙醇-95%无水乙醇-80%无水乙醇-70%无水乙醇中脱蜡，各5 min。随后高压锅内进行抗原修复(玻片置于柠檬酸缓冲液中)，在高压蒸汽锅冒气后，煮5 min，使抗原位点暴露，玻片置于室温冷却，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，共3次，5 min/次，轻轻擦干组织周围PBS，37℃血清封闭30 min，吸水纸擦干组织周围血清，滴加β-arrestin1抗体，按1∶500稀释，4℃孵育过夜。第2天进行PBS冲洗，共3次，5 min/次，擦干组织旁PBS，孵育二抗，37℃孵育60 min。

PBS冲洗共3次，5 min/次，加显色剂(按照Dako两步法免疫组化试剂盒的说明书进行操作，B溶液和C溶液按50∶1混合)，清水冲洗10 min后，苏木精复染，水中冲洗干净切片，依次放入70%无水乙醇-80%无水乙醇-95%无水乙醇-100%无水乙醇-二甲苯-二甲苯。各2 min，将切片置于通风橱中，中性树胶封片晾干，显微镜下采集200倍的图像，β-arrestin1蛋白表达的定性研究采用直接观察是否在胞质中表达，根据阳性细胞在全部组织细胞中所占比例和阳性细胞染色强度判定实验结果，A：按显色细胞数计分，阳性细胞数<1/3为1分，1/3～2/3为2分，>2/3为3分。B：按细胞显色深浅计分，无阳性反应细胞为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。积分数=A×B。A×B=0判断为(-)，A×B=1～2判断为(+)，A×B=3～4为()，A×B=5～9为()，β-arrestin1蛋白表达的半定量评分由本院三位病理科技术人员共同阅片打分，取平均值。

1.9 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验、单因素方差分析+LSD-t检验。

2 结 果

2.1 β-arrestin1在SPC-A-1、H460、H520、H1975细胞系和正常肺16HBE的表达 16HBE相比，β-arrestin1 mRNA和蛋白表达水平在NSCLC细胞系中均表达上调(P<0.05)。见图1。

2.2 β-arrestin1在NSCLC组和对照组中的表达 与对照组比较，β-arrestin1 mRNA和蛋白表达水平在NSCLC组织中均表达上调(P<0.05)。β-arrestin1定位于细胞质，细胞质呈棕黄色或棕褐色者为阳性染色。β-arrestin1在对照组中96.7%(29/30)染色弱阳性，为低表达，在NSCLC组中80.0%(24/30)染色强阳性，为高表达。见图2。

2.3 β-arrestin1对NSCLC细胞SPC-A-1增殖能力的影响 见图3。转染sh-β-arrestin1组的β-arrestin1蛋白和mRNA表达水平显著低于sh-control组，即转染成功。转染48 h后，与sh-control组相比，sh-β-arrestin1组的细胞增殖能力被显著抑制(P<0.05)。两组MTT OD平均值为0.91，0.33。

图1 β-arrestin1在NSCLC细胞系和16HBE中的表达

图2 β-arrestin1在NSCLC癌组织和癌旁组织中的表达(DAB，×200)

图3 β-arrestin1对NSCLC细胞SPC-A-1增殖能力的影响

3 讨 论

NSCLC患者的生存期和生活质量的改善状况仍不理想〔9〕。NSCLC的治疗方案常根据疾病的分期、组织类型、并发症或体力状况来决定，不同的病人所采用的治疗方案各不相同，其生存期的延长也不同〔10〕。因此发现NSCLC中异常表达的基因，寻找治疗NSCLC的特异性靶点，将大大提升临床上NSCLC患者的治疗效果。β-arrestin1是一类重要的多功能支架蛋白和信号调控因子，是Arrestin家族(S-arrestin、X-arrestin、β-arrestin1和β-arrestin2)成员之一，其广泛存在人体的各种组织细胞中，可通过促进GPCR的脱敏、内化或信号传导，从而激活多种受GPCR调控的信号通路，促进细胞的增殖分化活动〔4〕。另外β-arrestin1还参与了多种肿瘤的发生和发展过程，参与多种肿瘤相关的信号通路的调控，β-arrestin1的异常表达和功能异常在多种疾病的进展中发挥了重要作用，如β-arrestin1可促进肾脏、心血管、胆囊和肺的纤维化〔11〕。通过敲除小鼠的β-arrestin1基因，小鼠的存活率得到了明显提升，且敲除β-arrestin1的小鼠原始肺成纤维细胞表现出更弱的迁徙能力〔12〕。鉴于β-arrestin1在疾病发展中的重要作用，推测β-arrestin1在NSCLC中也发挥了重要的作用，可能是肺癌治疗的新靶点。

目前关于β-arrestin1在NSCLC组织和细胞系中的表达及其对肺癌细胞增殖影响的研究较少〔7,8〕，本研究从细胞系的角度表明了β-arrestin1的高表达与NSCLC疾病的发生有关，该结果与白血病细胞系中β-arrestin1高表达相一致〔13〕。本研究从病人组织标本的角度表明了β-arrestin1的高表达与NSCLC疾病的发生有关。其与β-arrestin1在肺腺癌组织中高表达并与血管内皮生长因子相关的研究一致〔14〕。细胞增殖实验结果显示β-arrestin1能显著抑制肺癌细胞SPC-A-1的增殖能力，与已有研究结果相一致〔13〕。本研究说明β-arrestin1有潜力成为NSCLC治疗的新靶点，通过β-arrestin1抑制剂干预NSCLC患者中β-arrestin1的表达，将可能延长NSCLC肿瘤患者的生存期，并最终改善患者的生存质量。

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〔2017-04-12修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

四川省医学科研青年创新课题(No.Q16008)

刘 波(1973-)，男，副主任医师，主要从事呼吸系统疾病的诊断及治疗研究。

刘 晓(1982-)，女，硕士，主治医师，主要从事肺癌的早期诊断与治疗研究。

R73

A

1005-9202(2017)13-3137-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.007